基于遗传编码非天然氨基酸技术的β-内酰胺类抗生素残留检测方法的研究

发布时间：2017-05-11 03:02

  本文关键词：基于遗传编码非天然氨基酸技术的β-内酰胺类抗生素残留检测方法的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：食品安全关系大众健康,是国家稳定发展的基础,随着我国居民饮食中动物源性食品占比不断增加,相关产品中抗生素残留已成为影响食品安全的主要形式之一。p-内酰胺类抗生素在兽药临床应用广泛,建立一种灵敏、稳定、简单的检测方法监控其在动物源性食品中的残留,是解决食品安全问题的重要手段。本文以青霉素结合蛋白(PBP2x)为研究对象,利用“遗传编码非天然氨基酸技术(UaaTech)"将荧光氨基酸7HC ((7-hydroxycoumarin-4-yl) ethylglycine)引入到PBP2x底物结合区域的不同位点,经过多条件优化,成功于大肠杆菌中获得了定点插入7HC的重组蛋白PBP2x_7HC(W374U和Y561U),产率达mg/L,并用质谱分析确证。系统研究了W374U结合15种β-内酰胺类抗生素前后的荧光光谱,发现其结合青霉素类抗生素后,用325nm激发,发射光强度明显增强,用366nm激发,发射光强度显著降低；而当其结合头孢菌素类抗生素后,在以上两种激发波长下,发射光强统一减弱。本研究将W374U固定在微孔板中,分别以366nm和450nm做为激发和发射波长,建立β-内酰胺类抗生素荧光分析法。该方法对青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、氯唑西林、苯唑西林、双氯西林、头孢噻呋、头孢喹肟、头孢洛宁、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢匹林和头孢乙腈的最低检测限分别为0.49～2.44 ng/mL,均低于欧盟最大残留限量(MRL),且检测范围良好,回归方程确定性系数R20.99。添加了抗生素的牛奶样本经过简单的前处理即可进行检测,原奶中回收率为78%～102%,成品奶中回收率为76%-112%。并以阿莫西林为标准品,建立了p-内酰胺类抗生素多残留筛选方法,检测限设为3.6 ng/mL,青霉素G等13种药物以MRL添加在牛奶样本中,均可检出为阳性。对采集的6个原奶样和超市购买的9个纯牛奶样进行检测,并与市售p-内酰胺类检测卡测试结果对比,二者完全一致。为进一步提高W374U的产率,我们首次从蛋白组水平研究了UaaTech对表达宿主的影响,发现面对琥珀抑制子压力时,大肠杆菌首先是通过转座子的插入突变来使得相关压力基因失效；当转座未命中目标而压力持续时,多达51种内源蛋白表达会有超过2倍的改变。这些结果为提高W374U产率和突破UaaTech的局限发掘了新的思路。总之,本论文利用UaaTech技术创新地将残留检测的捕获物和信号物统一为一个试剂,建立了灵敏的荧光分析法来检测β-内酰胺类抗生素,具有潜在的应用价值,同时示范了一种检测痕量小分子化合物的非竞争性受体分析法,是兽药残留检测方法的有益扩充。
【关键词】：β-内酰胺类抗生素 残留检测 非天然氨基酸 青霉素结合蛋白 荧光
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S859.84
【目录】：

• 摘要4-5
• abstract5-10
• 缩略词10-11
• 名词解释11-12
• 第一章 文献综述12-32
• 1 研究目的和意义12-13
• 2 β-内酰胺类抗生素概述13-17
• 2.1 β-内酰胺类抗生素及其分类13-15
• 2.2 作用机理及兽医临床应用15-17
• 3 β-内酰胺类抗生素残留检测技术进展17-20
• 3.1 微生物检测法18-19
• 3.2 理化检测法19
• 3.3 免疫分析法19-20
• 4 遗传编码非天然氨基酸技术概述20-29
• 4.1 技术的简介及其原理20-24
• 4.2 技术的应用24-29
• 5 荧光氨基酸7HC简介29-31
• 6 研究的内容和方法31-32
• 第二章 带荧光氨基酸的青霉素结合蛋白(PBP2x_7HC)的表达纯化32-58
• 1 实验材料32-35
• 1.1 试剂32-33
• 1.2 溶液系统33-34
• 1.3 菌株34
• 1.4 仪器设备34-35
• 2 方法35-44
• 2.1 青霉素结合蛋白PBP2x表达载体的构建35-38
• 2.2 PBP2x_W374TAG,PBP2x_Y561TAG表达载体构建38-40
• 2.3 正交tRNA及氨酰tRNA合成酶表达质粒的构建40-41
• 2.4 PBP2x_7HC表达测试41-42
• 2.5 PBP2x_7HC表达优化42-43
• 2.6 PBP2x_7HC大量生产和鉴定43-44
• 3 结果44-54
• 3.1 PBP2x目的基因的扩增45
• 3.2 PBP2x表达载体的构建与鉴定45-46
• 3.3 PBP2x_W374TAG,PBP2x_Y561TAG表达载体构建与鉴定46
• 3.4 7HC氨酰tRNA合成酶基因的扩增46-47
• 3.5 正交tRNA及氨酰tRNA合成酶表达质粒的构建与鉴定47-48
• 3.6 PBP2x_7HC表达测试48-49
• 3.7 PBP2x_7HC表达优化49-52
• 3.8 PBP2x_7HC大量表达和纯化52-53
• 3.9 PBP2x_7HC的理化分析53-54
• 3.10 PBP2x_7HC的质谱分析54
• 4 分析与讨论54-56
• 4.1 非天然氨基酸插入位点的选择54-55
• 4.2 PBP2x_7HC的表达和优化55-56
• 4.3 PBP2x_7HC大量生产的展望56
• 5 小结56-58
• 第三章 基于PBP2x_7HC的β-内酰胺类抗生素荧光检测法的建立58-77
• 1 实验材料58-60
• 1.1 标准品58
• 1.2 试剂58-59
• 1.3 奶样59
• 1.4 溶液系统59-60
• 1.5 仪器设备60
• 2 方法60-63
• 2.1 PBP2x_7HC荧光光谱的测定60
• 2.2 PBP2x_7HC与氨苄西林结合前后荧光光谱的测定60-61
• 2.3 PBP2x_7HC激发波长的确定61
• 2.4 基于PBP2x_7HC的荧光检测法的建立61-62
• 2.5 牛奶样本的前处理62-63
• 2.6 牛奶样品添加与回收63
• 2.7 基于PBP2X-7HC的多残留检测方法的建立63
• 2.8 实际牛奶样本的检测63
• 3 结果63-73
• 3.1 PBP2x_7HC的激发光谱及发射光谱63-64
• 3.2 PBP2x_7HC与氨苄西林结合前后激发光谱的变化和选择64
• 3.3 检测方法激发波长的确定64-67
• 3.4 基于PBP2x_7HC的β_内酰胺类抗生素荧光检测法67-71
• 3.5 牛奶样本前处理71
• 3.6 牛奶样本的添加回收率71-73
• 3.7 多残留样本的检测73
• 3.8 实际牛奶样本的检测73
• 4 分析与讨论73-76
• 4.1 基于PBP2X_7HC的检测方法的建立74-75
• 4.2 牛奶中多种β_内酰胺类抗生素残留的检测75
• 4.3 遗传编码荧光非天然氨基酸用于荧光检测75-76
• 5 小结76-77
• 第四章 提高PBP2x_7HC产率的研究77-94
• 1 实验材料77-80
• 1.1 试剂77-78
• 1.2 溶液系统78-79
• 1.3 菌株79
• 1.4 仪器设备79-80
• 2 方法80-83
• 2.1 质粒的构建80-81
• 2.2 表达宿主生长速度的测试81
• 2.3 琥珀抑制子压力下外源目的基因的表达测试81-82
• 2.4 UaaTech相关基因的完整性测试82
• 2.5 突变基因的分析82
• 2.6 宿主差异蛋白质组学质谱定量分析(iTRAQ)82-83
• 2.7 宿主内源性蛋白YdiI的调控及其对外源目的基因表达的影响分析83
• 2.8 宿主内源性蛋白YdiI的功能分析83
• 3 结果83-91
• 3.1 质粒的构建83-86
• 3.2 宿主生长速度的变化及外源目的基因表达的改变86-87
• 3.3 UaaTech相关基因的突变及分析87-88
• 3.4 宿主内源性蛋白表达水平的变化及分析88-89
• 3.5 宿主内源性蛋白YdiI的调控及其对外源目的基因表达的影响89-90
• 3.6 宿主内源性蛋白YdiI的功能分析90-91
• 4 分析与讨论91-93
• 4.1 表达宿主的表型变化92
• 4.2 表达宿主外源基因的变化92
• 4.3 表达宿主内源基因的变化92-93
• 4.4 YdiI基因调控尝试及功能确定93
• 5 小结93-94
• 第五章 结论94-95
• 创新点95-96
• 参考文献96-105
• 致谢105-106
• 个人简历106

  本文关键词：基于遗传编码非天然氨基酸技术的β-内酰胺类抗生素残留检测方法的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：356064