厚垣孢普克尼亚菌产生的金轮霉素对秀丽隐杆线虫作用靶点的研究

发布时间：2017-05-11 07:10

  本文关键词：厚垣孢普克尼亚菌产生的金轮霉素对秀丽隐杆线虫作用靶点的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：由于线虫抗药性的出现和绿色抗寄生线虫药物的匮乏,植物寄生线虫已成为危害农业生产的一个全球性问题。从微生物次生代谢产物中寻找新型高效广谱性抗线虫天然化合物并确定其作用机制是研发绿色抗线虫药物的重要手段。本研究以食线虫真菌厚垣孢普克尼亚菌(Pochonia chlamydosporia)中筛选得到的一类产率高、活性强的金轮霉素为研究对象,以秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)为模型探讨了该类化合物主要成分金轮霉素D对线虫的毒性机制,鉴定了线虫抗金轮霉素D的抗性突变位点。主要研究结果如下：1.对17株厚垣孢普克尼亚菌马铃薯葡萄糖液体培养基的发酵液进行杀线虫活性筛选,获得到三株对秀丽隐杆线虫毒性极强的菌株YMF1.00615, YMF1.00613和YMF1.00111。这三株真菌的PDB发酵液中均显示为亮黄色,化学分析检测到发酵液中均含有大量金轮霉素类化合物,定量分析发现金轮霉素D为抗线虫活性发酵液中的主要成分,产量超过300μg/mL。金轮霉素D在半致死浓度下可以抑制秀丽隐杆线虫进食速率和线虫幼虫发育,大大缩短线虫寿命,并减少线虫后代数目。活性测试发现金轮霉素D对南方根结线虫幼虫的毒性是对秀丽隐杆线虫毒性的两倍。2.通过微阵列芯片分析发现金轮霉素D可诱导秀丽隐杆线虫基因组中与脱毒,压力应激和免疫反应相关的大量基因表达水平发生上调。3.发现胰岛素生长因子信号通路中的叉头(DAF-16/FOX0)转录因子参与了线虫应对金轮霉素D毒性的过程。突变体daf-16(mu86)对金轮霉素D具有超敏感性,而负调控DAF-16的突变体daf-2(e1370)对金轮霉素D具有抗性。4.筛选得到了秀丽隐杆线虫抗金轮霉素D突变体。采用甲基磺酸乙酯随机诱变约60000个野生型N2品系基因组,通过F2遗传学筛选得到了4个对金轮霉素D具有抗性的突变品系M1, M2, M3, M4。确定M1对金轮霉素D的抗性表型是由单个基因的显性突变导致的。5.定位了M1中对金轮霉素D抗性突变位点。以M1突变体和CB4856品系为亲本,构建了F2群,经单核苷酸酸多态性(SNP)定位,将抗性突变位点限定到三号染色体-2.97厘摩至-1.57厘摩之间。同时对M1进行基因组测序,通过比对M1和用于诱变的N2品系线虫在2.97厘摩至-1.57厘摩区域之间的变异,最终确定ATP合成酶β亚基第471位精氨酸突变成了组氨酸。6.秀丽隐杆线虫ATP合成酶p亚基第471位精氨酸的位置在寄生线虫中通常也是精氨酸。在15种序列已知的寄生线虫中,11种寄生线虫在秀丽隐杆线虫ATP合成酶p亚基第471位精氨酸的位置是精氨酸。本研究从食线虫真菌厚垣孢普克尼亚菌中筛选得到具有杀线虫活性的金轮霉素D。通过对野生型秀丽隐杆线虫进行遗传学筛选,得到对金轮霉素D具有抗性的突变体。对抗性突变体进行SNP定位和基因组测序分析,发现ATP合成酶p亚基第471位精氨酸错义突变为了组氨酸,此突变保护突变体免受金轮霉素D的毒性影响。而且在ATP合成酶p亚基序列已知的15种寄生线虫中,11种寄生线虫中的这个位置都是精氨酸。所以本研究为寻找开发真菌来源的靶点新颖的广谱性杀线虫制剂提供了重要的参考价值。
【关键词】：厚垣孢普克尼亚菌 金轮霉素 秀丽隐杆线虫 ATP-2 根结线虫
【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S476.1
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 绪论10-38
• 1 生防真菌厚垣孢普克尼亚菌研究进展10-11
• 1.1 厚垣孢普克尼亚菌的生防机制10-11
• 1.2 厚垣孢普克尼亚菌次生代谢产物研究进展11
• 2 天然产物金轮霉素及其功能11-17
• 2.1 生物学来源及一般特性11-12
• 2.2 作为荧光探针12
• 2.3 抑制F_1F_o-ATP合成酶12-15
• 2.4 毒性15-16
• 2.5 作用机制研究现状16-17
• 3 秀丽隐杆线虫在小分子抗寄生虫药物作用靶点研究的作用17-38
• 3.1 研究优势17
• 3.2 研究策略17-19
• 3.3 在抗动物寄生虫小分子药物靶点研究中的作用19-34
• 3.4 在抗植物寄生虫小分子药物靶点研究中的作用34-38
• 第二章 厚垣孢普克尼亚菌中杀线虫化合物的筛选38-56
• 1 材料与方法38-45
• 1.1 主要试剂和仪器38-39
• 1.2 培养基和常用试剂的配制39-40
• 1.3 供试材料40
• 1.4 厚垣孢普克尼亚菌PDB发酵液对秀丽隐杆线虫和南方根结线虫毒性测试40-42
• 1.5 PDB发酵液中金轮霉素的化学检测42-43
• 1.6 厚普克尼亚菌发酵液对番茄生长情况的影响43-44
• 1.7 真菌PDB发酵液对植物病原真菌的拮抗作用44-45
• 2 结果与讨论45-55
• 2.1 利用ITS序列进行的菌种鉴定45-47
• 2.2 真菌PDB发酵液对秀丽隐杆线虫幼虫毒性测试结果47
• 2.3 PDB发酵液中金轮霉素含量47-49
• 2.4 金轮霉素D对秀丽隐杆线虫和南方根结线虫幼虫毒性测试结果49-50
• 2.5 厚垣孢普克尼亚菌对番茄生长情况的影响50-52
• 2.6 厚垣孢普克尼亚菌PDB发酵液对植物病原真菌的抑制作用52-55
• 3 小结55-56
• 第三章 金轮霉素D对秀丽隐杆线虫毒性研究56-74
• 1 材料与方法56-60
• 1.1 供试材料和试剂56
• 1.2 培养基和常用试剂的配制56
• 1.3 金轮霉素D对秀丽隐杆线虫毒性56-58
• 1.4 微阵列芯片分析金轮霉素D对秀丽隐杆线虫基因表达水平影响58-60
• 1.5 数据分析60
• 2 结果与讨论60-72
• 2.1 金轮霉素D对秀丽隐杆线虫毒性61-63
• 2.2 金轮霉素D对秀丽隐杆线虫基因表达水平的影响63-67
• 2.3 daf-16途径对金轮霉素D毒性的影响67-70
• 2.4 与天然免疫相关的反应70-72
• 3 小结72-74
• 第四章 秀丽隐杆线虫抗金轮霉素D突变的筛选及定位74-113
• 1 材料与方法75-90
• 1.1 主要试剂和仪器75-76
• 1.2 培养基和常用试剂的配制76
• 1.3 供试线虫76
• 1.4 筛选F_1F_o-ATP合成酶突变体对金轮霉素D抗性76-77
• 1.5 筛选金轮霉素D抗性突变体77-80
• 1.6 利用MT465株系对突变位点进行染色体定位80-81
• 1.7 利用CB4856株系对突变位点进行单核苷酸多态性定位81-89
• 1.8 金轮霉素D抗性突变体基因组重测序89-90
• 1.9 构建蛋白系统发育树90
• 2 结果与讨论90-111
• 2.1 F_1F_o-ATP合成酶突变体对金轮霉素D抗性91-93
• 2.2 甲基磺酸乙酯诱变和F2筛选获得金轮霉素D抗性突变体93-94
• 2.3 突变体与野生型亲本的回交实验94-95
• 2.4 判断突变体抗性是否为显性95-96
• 2.5 利用定位线虫品系对突变位点进行染色体初步定位96
• 2.6 利用单核苷酸多态性对突变位点进行染色体和区间定位96-98
• 2.7 突变体的全基因组测序98-111
• 3 小结111-113
• 创新与展望113-114
• 参考文献114-137
• 附录137-169
• 研究成果169-170
• 致谢170-171

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本文编号：356518