日本囊对虾中抗菌肽分子基因克隆及功能分析

发布时间：2017-05-11 22:00

  本文关键词：日本囊对虾中抗菌肽分子基因克隆及功能分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：在无脊椎动物中,由于其缺少传统意义上的适应性免疫,先天免疫系统在宿主对抗病原体的反应中发挥着非常重要的作用。抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)在先天免疫防御中发挥着效应分子的作用,可以直接杀死或清除病原微生物。在本论文中,我们以日本囊对虾为材料,对抗菌肽家族(含WAP结构域蛋白和抗脂多糖因子)中的成员进行了研究,得到以下结果：1.日本囊对虾含单一单一乳清酸性蛋白(WAP)结构域的抗菌肽的功能研究甲壳动物中含单一乳清酸性蛋白结构域(a single whey acidic protein domain, SWD)的抗菌肽属于Ⅲ型甲壳肽,具有蛋白酶抑制活性或抑菌活性。然而它在甲壳动物体内的功能尚未被阐述。在本论文中,我们在日本囊对虾中扩增得到一种SWD抗菌肽,称为MjSWD。MjSWD的全长为522bp,开放阅读框编码一条含24个氨基酸信号肽的蛋白。组织分布结果显示,MjSWD在血细胞、心、肝胰腺、鳃、胃和肠组织中均有表达,qRT-PCR分析其表达模式表明,对虾受到鳗弧菌、金黄色葡萄球菌和白斑病毒的刺激后MjSWD在鳃和胃中表达量上调。纯化的重组蛋白MjSWD可以通过结合细菌表面的肽聚糖结合革兰氏阳性菌和阴性菌,并且可以抑制丝氨酸蛋白酶活性,如枯草杆菌蛋白酶A、蛋白酶K,还可以抑制细菌分泌的蛋白酶活性。与重组蛋白孵育过的鳗弧菌在自然感染的情况下对日本对虾的感染能力明显低于对照组,说明MjSWD在对虾抗细菌免疫中发挥着重要的作用。2.日本囊对虾一种新型抗脂多糖因子的功能研究抗脂多糖因子(ALF)是甲壳动物中具有广谱抗菌活性的效应分子,在对虾中已发现四类抗脂多糖因子(ALF-A—ALF-B)。我们在日本囊对虾中得到一类新型抗脂多糖因子,命名为MjALF-E。E组中含有两条新型抗脂多糖因子,MjALF-E1和MjALF-E2。组织分布分析表明MjALF-E1主要在血细胞、心脏和小肠中高表达,而MjALF-E2主要表达在鳃、胃和小肠中,并且二者在受到细菌刺激后转录水平上都有所提高。重组表达的重组蛋白rMjALF-E2对细菌表面的多糖LPS和PGN表现出较弱的结合活性,人工合成的两种抗脂多糖因子的LPS结合的结构域多肽对细菌表面的多糖LPS和PGN有较强的结合活性。而且合成的多肽和重组表达的rMjALF-E2对革兰氏阴性菌有抑制活性。体内实验表明,MjALF-E2可以帮助体内弧菌清除。通过RNA干扰的方式敲降MjALF-EZ的表达,然后感染鳗弧菌,相对于对照组对虾的累计死亡率明显升高。综上所述,MjALF-E2在对虾抵抗细菌侵染的免疫系统中发挥着重要的作用。3.日本囊对虾中具有抗病毒的抗脂多糖因子(MjALF-D2)的功能研究抗脂多糖因子(ALF)的广谱抗菌活性在很多甲壳动物中都有报道,近几年还发现其具有抗病毒活性,但具体的抗病毒机理还不清楚。在本研究中,我们构建了日本囊对虾的9种抗脂多糖因子的重组表达载体,进行了重组表达与纯化。将纯化得到的重组蛋白与白斑综合征病毒(WSSV)孵育注射到对虾体内,分析对虾体内WSSV的复制,结果得到一种具有抗毒活性的抗脂多糖因子MjALF-D2。RT-PCR分析其在日本囊对虾各组织中的表达情况,MjALF-D2在除肝胰腺外的各组织中均有所分布,在鳃和胃组织中表达量最高。白斑病毒刺激后不同时间段的表达模式分析结果表明,在受到病原刺激后MjALF-D2表达量明显上调。体内实验结果表明：注射重组蛋白和白斑病毒的实验组对虾体内病毒的含量明显低于对照组对虾；相反的,通过注射双链RNA将MjALF-D2干扰掉后,对虾体内的病毒复制率升高。因此,体内感染白斑病毒的实验证明了MjALF-D2的抗毒活性。重组蛋白MjALF-D2还可以通过结合细菌表而的多糖与革兰氏阳性菌和阴性菌结合,并对少数细菌具有微弱的抑制活性。以上实验结果表明,MjALF-D2同时参与对虾抗病毒免疫反应。
【关键词】：日本囊对虾 先天免疫 抗菌肽 含单WAP结构域蛋白 蛋白酶抑制活性 抗脂多糖因子 白斑病毒
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;S945.4
【目录】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 符号说明12-14
• 第一部分 综述无脊椎动物先天免疫14-26
• 一、免疫系统概述14-15
• 1、先天免疫14
• 2、适应性免疫14-15
• 二、无脊椎动物先天免疫15-16
• 1、细胞免疫15
• 2、体液免疫15-16
• 三、甲壳动物中抗菌肽研究概述16-23
• 1、对虾素(Penaeidin)17
• 2、溶菌酶(Lysozymes)17
• 3、含WAP结构域蛋白(crustin)17-19
• 4、抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccaride factors)19-23
• 四、本研究目的和意义23-26
• 第二部分 日本囊对虾中抗菌肽性质与功能研究26-80
• 第一章 含单乳清酸性蛋白结构域的甲壳肽具有抑制细菌对日本囊对虾侵染的功能26-50
• 一、前言26-27
• 二、材料方法27-38
• 1. 材料27-28
• 1.1. 实验材料27
• 1.2. 菌株和载体27-28
• 1.3. 仪器和试剂28
• 2、方法28-38
• 2.1. 日本囊对虾免疫刺激及血细胞的分离28
• 2.2. mRNA提取28-29
• 2.3. cDNA第一链合成29
• 2.4. 序列分析29-30
• 2.5. 半定量RT-PCR30
• 2.6. 荧光定量RT-PCR30
• 2.7. 重组表达30-34
• 2.8. 丝氨酸蛋白酶抑制活性34-35
• 2.9. rMjSWD的抑制动力学35
• 2.10. rMjSWD的理化性质35-36
• 2.11 细菌结合实验36-37
• 2.12. Western blot37
• 2.13. rMjSWD抑制细菌分泌蛋白酶活性37
• 2.14. 弧菌自然感染对虾37-38
• 三、结果38-47
• 1. 序列分析38-39
• 2. 系统发生树的构建39-41
• 3. MjSWD在各组织中的分布及受病原刺激后表达变化41-42
• 4. 重组蛋白表达与纯化42
• 5. rMjSWD抑制蛋白酶活性和抑制动力学42-44
• 6. rMjSWD的理化性质44
• 7. rMjSWD通过结合细菌表面的多糖具有结合细菌活性44-45
• 8. rMjSWD抑制细菌分泌的蛋白酶活性45-46
• 9. rMjSWD保护虾体不受细菌感染46-47
• 四、讨论47-50
• 第二章 日本囊对虾中抗脂多糖因子具有抗菌活性50-68
• 一、前言50-51
• 二、材料方法51-56
• 1. 菌株和载体51
• 2. 仪器和试剂51-52
• 3. 实验材料52
• 4. 方法52-56
• 4.1. 日本囊对虾免疫刺激及血细胞的分离52
• 4.2. mRNA提取52
• 4.3. cDNA第一链合成52
• 4.4. 序列分析52
• 4.5. 半定量RT-PCR52-53
• 4.6. 荧光定量RTPCR53
• 4.7. 重组表达53
• 4.8. 重组蛋白大规模表达纯化53-54
• 4.9. 液体抑菌实验54
• 4.10. 多糖结合实验54-55
• 4.11. 体内清除实验55-56
• 三、实验结果56-64
• 1. 序列分析及系统发生树构建56-59
• 2. ALFs的组织分布59-60
• 3. 细菌刺激后MjALF-Es高表达60
• 4. rMjALF-Es可以抑制革兰氏阴性菌的生长60-61
• 5. 多糖结合活性61-62
• 6. 体内弧菌清除62-64
• 7. 致死率统计64
• 四、讨论64-68
• 第三章 日本囊对虾的D-类抗脂多糖因子具有抗病毒的功能68-80
• 一、前言68-69
• 二、材料和方法69-72
• 1. 菌株,病毒、载体和实验试剂69
• 2. 实验材料和免疫刺激69
• 3. 血细胞分离与组织RNA提取69
• 4. 半定量RT-PCR和实时定量qRT-PCR69-70
• 5. 重组蛋白表达纯化70-71
• 6. 重组蛋白抗病毒活性检测71
• 7. 在MALF-D2沉默的对虾中WSSV的复制率检测71
• 8. 血细胞体外培养及WSSV病毒感染71
• 9. Westem b1ot71-72
• 三、结果72-77
• 1、重组表达六种ALF,检测体内抗病毒活性72-73
• 2、MjALF-D2的组织分布和表达模式73-74
• 3、重组蛋白rMjALF-D2抑制WSSV在体内的复制74-75
• 4、WSSV在MjALF-D2沉默的对虾体内复制量升高75-77
• 5、重组蛋白rMjALF-D2可以保护血细胞免受WSSV侵染77
• 四、讨论77-80
• 论文的创新点及意义80-82
• 参考文献82-89
• 致谢89-90
• 在读期间发表文章90-91
• 附件91

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 卜兴江;杜欣军;周文杰;赵小凡;王金星;;中国明对虾溶菌酶基因克隆、重组表达与性质分析[J];生物工程学报;2008年05期

  本文关键词：日本囊对虾中抗菌肽分子基因克隆及功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：358120