TALE切口酶介导SP110基因定点敲入生产抗结核病转基因牛的研究

发布时间：2017-05-12 14:10

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【摘要】：结核病是一种由结核分支杆菌在人与动物或者人与人之间传播引起的人畜共患病。牛结核病在全世界范围内传播严重的影响了人类健康和农业发展,特别是在亚洲和非洲的一些发展中国家,由于没有有效的政策和方案来消除或控制,结核病的危害尤其严重。因此控制和抵御结核菌传播的研究变的紧迫和重要。有文献报道小鼠SP110基因可以控制结核杆菌的生长并且诱导感染细胞凋亡,本研究的前期工作也确认SP110基因可以增强牛巨噬细胞的抗结核菌功能。因此本研究旨在通过TALE核酸切口酶在荷斯坦奶牛基因组上定点插入SP110基因,生产具有抵抗结核杆菌侵染功能的转基因牛。基因组编程酶TALEN能够在精确位点对基因组进行切割,因此被广泛用于基因功能研究以及转基因动物的生产。在过去的两年中,TALEN介导的基因敲除已有大量文献报道,但是基因敲入成功的例子却非常少;TALEN介导的基因组修饰已成功应用于多种模式动物并生产转基因动物,但是尚未见有TALEN介导基因敲入的转基因牛报道。本研究首次利用TALE核酸切口酶在牛基因组上进行基因敲入,并生产出13头SP110基因定点敲入的转基因牛。通过体外攻菌证明转基因牛巨噬细胞可以控制结核杆菌的生长和增殖,结核杆菌侵染的转基因细胞会启动凋亡途径而不是坏死途径;通过体内攻菌以及细菌传染试验证明转基因牛可以有效的抵御结核杆菌的侵染。本研究的主要内容如下所示:1.针对牛28号染色体的表面活化蛋白A1(SFTPA1)和甲硫氨酸腺苷基转移酶I A(MAT1A)的基因间序列设计3对特异性的TALENs。使用荧光素酶单链退火实验在人的293-FT细胞中对TALENs的切割活性进行的了初步鉴定。随后用Surveyor酶切实验在牛的胎儿成纤维细胞中进行了进一步检测,以DNA切割后发生非同源末端连接修复的比率来表征TALENs的切割活性,结果表明所设计的三对TALENs中,第二对TALEN的切割活性最高。2.在野生型TALEN右臂的FokI酶中引入一个点突变(第450位天冬氨酸突变为丙氨酸),该点突变可以消除右臂FokI的酶切活性,但不影响TALEN二聚化以及DNA序列的识别,从而构建TALE核酸切口酶系统。DNA体外切割试验证明了该系统可以在预期的位点造成单链断裂,并具有将DNA修复途径限定为同源重组的能力。3.获得SP110定点打靶的阳性细胞克隆。通过junction PCR及Southern blot实验确认为定点打靶并且筛选出单等位基因打靶的细胞。以此细胞为核供体,通过体细胞核移植生产出13头SP110基因定点敲入的转基因牛。4.对转基因牛的巨噬细胞进行体外攻菌试验,结果表明转基因牛巨噬细胞可以控制结核杆菌的生长和增殖。利用流式细胞术分析攻菌后巨噬细胞的凋亡率和坏死率,发现结核杆菌侵染的普通巨噬细胞会启动坏死途径,而转基因牛巨噬细胞则会启动凋亡途径;使用支气管点滴法进行体内攻菌试验,尸检发现转基因牛脏器的病理得分以及荷菌数均明显低于普通牛;通过将转基因牛与结核病牛在密闭环境下共同饲养的方法进行模拟传染试验,皮试检测、伽马干扰素释放水平检测以及酶联免疫斑点检测均证明转基因牛具有拮抗结核菌的功能,尸检发现转基因牛脏器的病理得分显著低于普通牛。5.针对肌成束同源蛋白1(FSCN1)和肌动蛋白(ACTB)的基因间序列设计并构建3对TALENs并获得针对F-A位点打靶的单克隆细胞。通过序列相似性比对,在牛基因组上分别找了8个靶向M-S位点和F-A位点TALE切口酶的潜在脱靶位点并进行脱靶效应分析。在22株F-A位点打靶细胞和19株F-A位点打靶细胞中发现一株细胞克隆存在脱靶效应。说明TALE切口酶虽然可以在牛基因组上任意位点进行基因操作,但仍有可能会对细胞造成不可预知的损伤,因此在基因敲入前需要注意寻找可以容纳外源基因的“安全港湾”。本研究首次利用TALE切口酶对牛基因组进行基因敲入,并生产出具有抗结核病功能的转基因牛。研究结果不仅对牛结核病的防御与控制有重大意义,同时为动物抗病育种提供新思路。
【关键词】：TALEN 基因打靶 同源重组 结核病 转基因牛
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.23
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-15
• 文献综述15-43
• 第一章 转基因动物研究进展15-31
• 1.1 转基因动物的发展史15-16
• 1.2 转基因动物的应用16-21
• 1.2.1 转基因动物在理论研究上的应用16
• 1.2.2 转基因动物在医学上的应用16-18
• 1.2.3 转基因动物在农业上的应用18-21
• 1.3 基因打靶技术的研究进展21-31
• 1.3.1 转座子21-25
• 1.3.2 锌指核酸酶25-27
• 1.3.3 TALEN27-28
• 1.3.4 RGEN（CRISPR/Cas RNA-Guided Nuclease）系统28-31
• 第二章 TALEN在动物遗传修饰中的应用31-43
• 2.1 TALEN的发明31-32
• 2.2 TALEN的设计与构建32-35
• 2.2.1 TALEN的设计32-33
• 2.2.2 TALEN表达载体的构建方法33-35
• 2.3 TALEN与ZFN和RGEN的特点比较35-39
• 2.3.1 切割成功率和切割效率36
• 2.3.2 DNA序列识别特异性36-37
• 2.3.3 细胞毒性37-39
• 2.4 TALEN介导的基因修饰的应用39-43
• 2.4.1 在细胞水平上的应用40-41
• 2.4.2 在模式动物上的应用41
• 2.4.3 在家畜上的应用41-43
• 试验研究43-106
• 第三章 TALEN真核表达载体的构建及活性分析43-57
• 3.1 材料和试剂43-44
• 3.1.1 材料43
• 3.1.2 试剂43-44
• 3.2 方法44-49
• 3.2.1 TALEN真核表达载体的构建44-46
• 3.2.2 TALEN在 293-FT细胞中的切割活性分析46-47
• 3.2.3 TALEN在BFFs细胞中的切割活性分析47-49
• 3.2.4 TALE切.酶的构建及活性检测49
• 3.3 结果49-56
• 3.3.1 TALEN真核表达载体的构建49-52
• 3.3.2 TALEN在 293-FT细胞中的切割活性分析52
• 3.3.3 TALEN在BFFs细胞中的切割活性分析52-54
• 3.3.4 TALE核酸切.酶活性检测54-56
• 3.4 讨论56
• 3.5 小结56-57
• 第四章 SP110定点打靶细胞筛选及转基因牛生产57-74
• 4.1 材料和试剂57-58
• 4.1.1 材料57
• 4.1.2 试剂57-58
• 4.2 方法58-63
• 4.2.1 MSR1启动子活性验证58-59
• 4.2.2 小鼠SP110基因功能验证59-60
• 4.2.3 打靶载体构建60-61
• 4.2.4 细胞筛选及验证61-63
• 4.2.5 体细胞核移植生产转基因牛63
• 4.3 结果63-73
• 4.3.1 MSR1启动子活性验证63-64
• 4.3.2 SP110基因功能验证64-66
• 4.3.3 打靶载体构建66-67
• 4.3.4 细胞筛选及验证67-71
• 4.3.5 体细胞核移植生产转基因牛71-73
• 4.4 讨论73
• 4.5 小结73-74
• 第五章 转基因牛抗结核菌验证74-96
• 5.1 材料和试剂74-75
• 5.1.1 材料74
• 5.1.2 试剂74-75
• 5.2 方法75-80
• 5.2.1 Junction PCR75
• 5.2.2 Genome walking75
• 5.2.3 Southern blot75
• 5.2.4 Western Blot75-76
• 5.2.5 Real Time RT-PCR76-77
• 5.2.6 细胞CFU计数77
• 5.2.7 流式细胞术分析凋亡率77
• 5.2.8 病理学评分系统77-78
• 5.2.9 器官CFU计数78
• 5.2.10 结核菌传染实验78
• 5.2.11 结核菌素皮肤试验78-79
• 5.2.12 IFN-γ释放水平检测79
• 5.2.13 酶联免疫斑点试验（ELISPOT）79
• 5.2.14 苏木精-伊红染色（HE染色）79
• 5.2.15 数据统计分析79-80
• 5.3 结果80-94
• 5.3.1 Junction PCR验证阳性细胞80
• 5.3.2 Genome walking验证阳性细胞80-81
• 5.3.3 Southern Blot筛选单等位基因打靶克隆81-82
• 5.3.4 Western Blot验证SP110基因的表达82
• 5.3.5 外周血单核细胞诱导分化为巨噬细胞82-83
• 5.3.6 Real-Time RT PCR检测临近基因表达水平83-84
• 5.3.7 细胞水平上攻菌后CFU计数84-85
• 5.3.8 流式细胞术分析细胞死亡方式85
• 5.3.9 体内攻菌后的病理评分85-87
• 5.3.10 体内攻菌后的器官CFU计数87
• 5.3.11 传染实验中的结核菌素皮试检测87-88
• 5.3.12 传染实验中的IFN-γ释放水平88-89
• 5.3.13 酶联免疫斑点检测产生IFN-γ反应的细胞数89-90
• 5.3.14 传染实验后的病理学评分90-91
• 5.3.15 传染实验后的病理切片检测91
• 5.3.16 SP110转基因牛子代分析91-94
• 5.4 讨论94-95
• 5.5 小结95-96
• 第六章 TALE核酸切.酶应用评估96-106
• 6.1 材料和试剂96-97
• 6.1.1 材料96
• 6.1.2 试剂96-97
• 6.2 方法97-98
• 6.2.1 针对F-A位点TALEN表达载体的构建97
• 6.2.2 BFF细胞中检测F-A位点TALENs的切割活性97
• 6.2.3 转基因克隆胚构建以及体细胞核移植97
• 6.2.4 Real-Time PCR检测F-A位点临近基因的表达水平97-98
• 6.2.5 TALEN的脱靶效应分析98
• 6.3 结果98-104
• 6.3.1 TALEN在F-A位点打靶98-101
• 6.3.2 TALEN的脱靶效应分析101-104
• 6.4 讨论104-105
• 6.5 小结105-106
• 全文结论106-107
• 创新之处和进一步研究的课题107-108
• 参考文献108-122
• 附录122-137
• 致谢137-138
• 个人简介138

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 肖安;胡莹莹;王唯晔;杨志們;王展翔;黄鹏;佟向军;张博;林硕;;人工锌指核酸酶介导的基因组定点修饰技术[J];遗传;2011年07期

2 Chuanxian Wei;Jiyong Liu;Zhongsheng Yu;Bo Zhang;Guanjun Gao;Renjie Jiao;;TALEN or Cas9-Rapid,Efficient and Specific Choices for Genome Modifications[J];遗传学报(英文版);2013年06期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 王勇胜;优化核移植技术并生产转人溶菌酶和β-防御素-3克隆牛的研究[D];西北农林科技大学;2009年

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本文编号：359977