miR1432调控水稻籽粒灌浆充实的分子机制研究

发布时间：2022-02-19 01:57

　　miRNA是植物生长发育和生理调控的重要影响因子,逐渐成为培育优良籽粒大小和作物产量的新靶标。水稻籽粒灌浆速率对籽粒大小及营养物质的积累有较大影响。实验室前期研究结果表明,miR1432在水稻强弱势粒灌浆中时序性差异表达,本研究利用谷蛋白特异启动子Gt13a,构建了胚乳特异性过表达miR1432（OXmiR1432）和低表达miR1432（STTM1432）的转基因材料,通过对miR1432组织表达模式分析、转基因材料鉴定、籽粒表型分析及灌浆速率和灌浆参数的拟合等,初步得出miR1432负向调控水稻籽粒灌浆充实的结论。进一步通过生物信息学预测,烟草瞬时转染系统和5’RACE的实验手段,分析鉴定出miR1432直接调控的下游靶基因OsACOT。通过对OsACOT抗miR1432转基因材料表型鉴定,共表达基因分析及转基因植株籽粒中内源激素IAA和ABA含量的测定,结合miR1432转基因材料花后10天胚乳转录组测序数据分析,推测miR1432-OsACOT调控模式可能通过调控内源激素含量从而影响水稻籽粒灌浆充实,进而决定籽粒大小和产量高低。主要研究结果如下:1、为明确miR1432在水稻发... 

【文章来源】：河南农业大学河南省

【文章页数】：120 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
致谢
摘要
缩略词
第一章 绪论
    1.1 选题的目的和意义
    1.2 植物miRNAs的特征、合成及作用机制
        1.2.1 miRNAs的特征
        1.2.2 miRNAs的合成
        1.2.3 miRNA的作用机制
    1.3 miRNA在植物中的功能研究
        1.3.1 miRNA与植物形态建成
        1.3.2 miRNA与植物信号转导
        1.3.3 miRNA在植物种子发育过程中的作用
    1.4 miR1432在植物生长发育中的研究进展
    1.5 酰基辅酶A硫酯酶研究进展
    1.6 研究目的和拟研究内容
第二章 miR1432负调控水稻籽粒灌浆充实
    2.1 材料与方法
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 实验方法
            2.1.2.1 植物叶片DNA提取(CTAB法)
            2.1.2.2 pCAMBIA1301::Gt13a::MIR1432/STTM1432::Nos载体构建
            2.1.2.2 OXmiR1432与STTM1432转化农杆菌
            2.1.2.3 OXmiR1432与STTM1432转基因植株的获得
            2.1.2.4 植物组织RNA提取
            2.1.2.5 miRNA反转录(天根Fast King RT Kit with g DNAase:KR116)
            2.1.2.6 Stem_loop荧光定量PCR(天根Talent荧光定量检测试剂盒FP209)
            2.1.2.7 Southern杂交
            2.1.2.8 Northern杂交
            2.1.2.9 GUS染色
            2.1.2.10 取样及籽粒干重测量
            2.1.2.11 籽粒特征测定及灌浆参数拟合
    2.2 结果与分析
        2.2.1 miR1432表达模式分析
        2.2.2 miR1432在转基因植株中表达量鉴定及籽粒表型
        2.2.3 miR1432负向调控水稻籽粒大小
        2.2.4 miR1432不同转基因株系灌浆参数拟合
    2.3 小结与讨论
第三章 miR1432下游靶基因的预测与鉴定
    3.1 材料与方法
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 实验方法
            3.1.2.1 miR1432靶基因的预测
            3.1.2.2 基础载体PHB::MIR1432及PHB::target的构建
            3.1.2.3 PHB::MIR1432及PHB::target转化农杆菌
            3.1.2.4 烟草瞬时转染
            3.1.2.5 RLM-5’RACE(Invitrogen公司:First Choice RLM-RACE Kit, AM1700)
    3.2 结果与分析
        3.2.1 生物信息学预测miR1432下游靶基因
        3.2.2 预测靶基因在miR1432转基因植株中表达量
        3.2.3 烟草瞬时转染验证miR1432靶基因
        3.2.4 RLM-5’RACE验证miR1432与靶基因之间切割位点
        3.2.5 miR1432负向调控Os ACOT的转录
    3.3 结论与讨论
第四章 Os ACOT 正向调控水稻籽粒灌浆充实
    4.1 材料与方法
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 实验方法
            4.1.2.1 Os ACOT抗mi R1432切割载体OXm ACOT的构建
            4.1.2.2 OXm ACOT转化农杆菌
            4.1.2.3 OXm ACOT转基因阳性植株的获得
            4.1.2.4 籽粒 RNA 提取（全式金 ET121 Transzol Plant）
            4.1.2.5 反转录
            4.1.2.6 荧光定量PCR
            4.1.2.7 取样及籽粒千粒重测量
            4.1.2.8 籽粒特征测定及灌浆参数拟合
    4.2 结果与分析
        4.2.1 OXm ACOT转基因材料的鉴定
        4.2.2 Os ACOT正向调控水稻籽粒大小
        4.2.3 OXm ACOT转基因植株籽粒表型分析
        4.2.4 OXm ACOT灌浆速率测定及灌浆参数拟合
    4.3 结论与讨论
第五章 miR1432 调控水稻籽粒灌浆的转录组分析
    5.1 材料与方法
        5.1.1 实验材料
        5.1.2 实验方法
            5.1.2.1 RNA-seq测序
            5.1.2.2 差异表达基因鉴定和基因功能注释
    5.2 结果与分析
        5.2.1 RNA-seq数据验证
        5.2.2 转录组数据的整体分析
        5.2.3 蔗糖-淀粉代谢相关基因在差异表达基因中的分析
        5.2.4 生长素合成及信号转导相关基因在差异表达基因中的分析
        5.2.5 ABA合成及信号转导相关基因在差异表达基因中的分析
    5.3 结论与讨论
第六章 miR1432-Os ACOT调控水稻籽粒灌浆充实的生理分子机制
    6.1 材料与方法
        6.1.1 实验材料
        6.1.2 实验方法
            6.1.2.1 Os ACOT基因同源性分析
            6.1.2.2 Os ACOT共表达基因分析
            6.1.2.3 IAA和ABA测定
            6.1.2.4 脂肪酸含量测定
    6.2 结果与分析
        6.2.1 OsACOT基因同源性分析
        6.2.2 OsACOT共表达基因分析
        6.2.3 OsACOT共表达基因验证
        6.2.4 OsACOT参与中链脂肪酸的合成
        6.2.5 miR1432-Os ACOT模块参与IAA和ABA的合成
    6.3 结论与讨论
第七章 总结和下一步研究计划
    7.1 主要研究结论
    7.2 创新点
    7.3 下一步研究计划
参考文献
附表
英文摘要
博士期间发表学术论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]植物逆境胁迫相关miRNA研究进展[J]. 王维,张玉娟,陈洁,刘聚波,夏民旋,沈法富.  生物技术通报. 2015(01)
[2]植物逆境microRNA的研究进展[J]. 艾佳,李永光,王涛,宋北光,杨德光,李文滨.  基因组学与应用生物学. 2014(05)
[3]植物miRNA抗逆性研究进展[J]. 马风勇,朱永兴,石晓霞,许兴.  西北农林科技大学学报(自然科学版). 2012(05)
[4]植物microRNA与逆境响应研究进展[J]. 许振华,谢传晓.  遗传. 2010(10)
[5]Plant fertility defects induced by the enhanced expression of microRNA167[J]. Peng Ru~1 Lin Xu~1 Hong Ma~(2,3) Hai Huang~(1,2) ~1National Laboratory of Plant Molecular Genetics,Shanghai Institute of Plant Physiology and Ecology,Shanghai Institute for Biological Sciences,300 Fenglin Road,Shanghai 200032,China;~2SIBS-SJTU-PSU Joint Center for Life Sciences,Shanghai Institute of Plant Physiology and Ecologgy,Shanghai Institute for Biological Sciences,300 Fenglin Road,Shanghai 200032,China;~3Department of Biology and the Huck Institute for the Life Sciences,The Pennsylvania State University,University Park,PA 16802,USA.  Cell Research. 2006(05)



本文编号：3631983