结核分枝杆菌丝氨酸蛋白酶Rv3194c的特性及其对致病性影响的研究

发布时间：2022-04-28 21:29

　　结核病（Tuberculosis）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）引起的一种慢性、消耗性人兽共患传染病,可通过患者咳嗽或打喷嚏时形成的带菌气溶胶,在人与人、人与动物之间传播。据报道,结核病是全球范围内危害人类健康的十大重要传染病之一,每年约有一千万人感染结核病,造成约一百七十万人死亡。近些年来,由于多重耐药结核分枝杆菌（MDR-TB）及广谱耐药结核分枝杆菌（XDR-TB）的流行及其与HIV病毒的混合感染,使得结核病的防控变得更加困难。因此,迫切需要我们阐明结核病的发病机制,寻找结核病新的药物作用靶点,创制新型疫苗以降低该病给人类健康造成的危害。众所周知,肺泡巨噬细胞是MTB主要感染及入侵的靶细胞,在MTB感染细胞的过程中,许多毒力因子都发挥了重要的作用。而丝氨酸蛋白酶类是MTB的一类重要的毒力因子,与菌体对巨噬细胞的侵袭以及在巨噬细胞中的持留密切相关,但该酶类的理化特性及其在致病性方面所扮演的具体作用仍有待进一步研究。本研究利用生物信息学方法,分析了Rv3194c蛋白可能为MTB的一个潜在的胞外丝氨酸蛋白酶,在大肠杆菌中表达并纯化了结核分... 

【文章页数】：89 页

【学位级别】：博士

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摘要
abstract
英文缩略表
第一章 引言
    1.1 结核分枝杆菌与结核病的概述
    1.2 结核病的流行病学概述
    1.3 结核病的微生物学和致病机制研究
        1.3.1 结核分枝杆菌和宿主之间的相互作用
        1.3.2 结核分枝杆菌的毒力研究
        1.3.3 结核病的免疫学研究
        1.3.4 肉芽肿的形成
        1.3.5 结核分枝杆菌的耐药性研究
    1.4 丝氨酸蛋白酶
        1.4.1 丝氨酸蛋白酶的种类
        1.4.2 丝氨酸蛋白酶的结构
        1.4.3 丝氨酸蛋白酶的功能
    1.5 革兰氏阴性菌中的丝氨酸蛋白酶
        1.5.1 蛋白酶的转运机制
        1.5.2 HtrA及 HtrA样丝氨酸蛋白酶
    1.6 革兰氏阳性菌中的丝氨酸蛋白酶
    1.7 结论
    1.8 本研究的目的与意义
第二章 RV3194C蛋白的纯化与多克隆抗体的制备
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验动物、载体和菌株
        2.1.2 实验试剂
        2.1.3 实验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 引物的设计
        2.2.2 结核分枝杆菌rv3194和rv0983基因的扩增
        2.2.3 rv3194和rv0983基因原核表达质粒的构建
        2.2.4 重组质粒的诱导与表达
        2.2.5 Rv3194c和 Rv0983c蛋白的纯化
        2.2.6 蛋白质的质谱验证
        2.2.7 抗Rv3194c蛋白多克隆抗体的制备
    2.3 实验结果
        2.3.1 目的基因的扩增与重组质粒双酶切鉴定
        2.3.2 Rv3194c和 Rv0983c蛋白的表达
        2.3.3 Rv3194c和 Rv0983c蛋白的纯化
        2.3.4 Rv3194c蛋白的Westernblot鉴定
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 结核分枝杆菌RV3194C丝氨酸蛋白酶活性研究
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验试剂
        3.1.2 实验仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 Rv3194c蛋白酶活性与蛋白酶底物的测定
        3.2.2 不同pH值及温度对Rv3194c酶活性的影响
        3.2.3 不同二价金属离子对Rv3194c酶活性的影响
        3.2.4 Rv3194c蛋白酶活性的动力学研究
        3.2.5 Rv3194c蛋白酶抑制剂的筛选
        3.2.6 Rv3194c蛋白酶活性中心的确定
        3.2.7 圆二色谱分析Rv3194c及其突变体二级结构的稳定性
    3.3 实验结果
        3.3.1 Rv3194c丝氨酸蛋白酶活性的鉴定
        3.3.2 不同pH和温度对Rv3194c活性的影响
        3.3.3 不同二价金属离子对Rv3194c活性的影响
        3.3.4 Rv3194c蛋白酶活性的动力学研究
        3.3.5 Rv03194c酶活性抑制剂的筛选
        3.3.6 点突变蛋白的纯化与活性测定
        3.3.7 圆二色谱分析
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 结核分枝杆菌RV3194C的致病性研究
    4.1 实验材料
        4.1.1 实验动物和细胞
        4.1.2 菌株和载体
        4.1.3 实验试剂
        4.1.4 实验仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 重组耻垢分枝杆菌的构建
        4.2.2 细菌组分分离与蛋白的亚细胞定位
        4.2.3 重组菌生长曲线的测定及抑菌实验
        4.2.4 细胞实验
        4.2.5 小鼠感染试验
    4.3 实验结果
        4.3.1 重组耻垢分枝杆菌及BCG中 Rv3194c的定位分析
        4.3.2 重组菌生长曲线的测定及桦木酸体外抑菌实验
        4.3.3 Rv3194c抑制巨噬细胞迁徙、吞噬和趋化作用
        4.3.4 重组菌在小鼠肺内的定殖能力及肺脏病理检测
        4.3.5 Rv3194c上调炎性细胞因子的表达
    4.4 讨论
    4.5 小结
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]丝氨酸蛋白酶研究进展[J]. 汪世华,王文勇,黄益洲,林琳,沙莉.  福建农业学报. 2007(04)
[2]基于结构的丝氨酸蛋白酶超家族进化分析[J]. 季星来,孙之荣.  电子学报. 2001(S1)
[3]丝氨酸蛋白酶超家族分子结构进化研究[J]. 孙之荣,王钰,胡胜民,郭青,贺福初.  生物物理学报. 1999(03)
[4]丝氨酸蛋白酶的蛋白质工程[J]. 张龙翔.  生命的化学(中国生物化学会通讯). 1992(02)



本文编号：3649568