奶牛乳房炎中葡萄球菌耐药性检测及多糖连接酶LcpC功能与机制研究

发布时间：2022-04-27 23:30

　　我国奶牛养殖业中普遍存在抗生素滥用的问题,抗生素滥用往往会催生多重耐药细菌,对公共卫生安全造成威胁。其中,因感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus,MRSA）而导致的奶牛乳房炎,往往给奶牛健康和奶业生产造成严重威胁。治疗MRSA所导致的感染往往有以下两个难点:（1）MRSA可能带有多重耐药基因,对多种抗生素具有耐药性,限制了可治疗药物的选择;（2）金黄色葡萄球菌可粘附并侵入宿主细胞内,从而逃避了宿主击杀和抗生素的作用。为了解陕西地区多重耐药的葡萄球菌流行状况,为指导陕西地区奶牛的健康养殖提供理论依据和参考,本课题组在陕西本地三家不同规模的奶牛养殖场中,选取了53头疑似患有奶牛乳房炎的奶牛,共采集得到了200份牛奶样品,从这些样品中,分离得到了144株葡萄球菌（吴兆韡,2018）。在此基础上,对这144株葡萄球菌进行了4种畜牧生产中常用抗生素（头孢唑林、替考拉宁、环丙沙星和氯霉素）的耐药检测试验。试验结果发现:144株葡萄球菌中,7.6%的菌株对替考拉宁耐药,14.6%的菌株对头孢唑林耐药,50%的菌株对环丙沙... 

【文章页数】：116 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 奶牛健康养殖
    1.2 抗生素对奶牛养殖的潜在危害
    1.3 奶牛乳房炎
        1.3.1 奶牛乳房炎的类型及诊断
        1.3.2 奶牛乳房炎的危害
    1.4 引起奶牛乳房炎的主要病原菌
        1.4.1 金黄色葡萄球菌
        1.4.2 链球菌属
        1.4.3 大肠杆菌
        1.4.4 血浆凝固酶阴性的葡萄球菌
    1.5 金黄色葡萄球菌的耐药性
        1.5.1 青霉素和甲氧西林的耐药性
        1.5.2 针对PBP2a的新型β-内酰胺类抗生素耐药性
        1.5.3 万古霉素的耐药性
    1.6 金黄色葡萄球菌的细胞壁
        1.6.1 肽聚糖
        1.6.2 壁磷壁酸
        1.6.3 荚膜多糖
        1.6.4 表面蛋白
    1.7 Lyt R-Cps A-Psr家族蛋白
    1.8 利用CRISPR-Cas9系统对金黄色葡萄球菌基因敲除
    1.9 本研究的目的和意义及主要研究内容
        1.9.1 研究目的和意义
        1.9.2 主要研究内容
试验部分
    第二章 奶牛乳房炎来源的葡萄球菌的抗性检测
        2.1 实验材料
            2.1.1 试剂
            2.1.2 主要仪器设备
        2.2 试验方法
            2.2.1 Mueller-Hinton琼脂培养基
            2.2.2 琼脂稀释法平板的准备
            2.2.3 菌液的准备与处理
            2.2.4 琼脂稀释法平板的接种和培养
            2.2.5 MIC的读取
            2.2.6 耐药菌株的各抗性示意图
        2.3 试验结果
        2.4 讨论
        2.5 小结
    第三章 奶牛乳腺来源的MRSA中与耐药有关基因的敲除体构建及相关表型的检测
        3.1 试验材料
            3.1.1 菌株
            3.1.2 质粒
            3.1.3 引物及序列信息
            3.1.4 试剂
            3.1.5 主要仪器及设备
        3.2 试验原理及方法
            3.2.1 CRISPR-Cas9 敲除质粒的构建
            3.2.2 构建过表达载体pSE1-16
            3.2.3 金黄色葡萄球菌的电转感受态细胞的制备及电转化
            3.2.4 构建敲除菌株
        3.3 相关表型检测
            3.3.1 菌株耐药性的检测
            3.3.2 金黄色葡萄球菌生物膜形成能力的检测
            3.3.3 统计分析方法
        3.4 结果
            3.4.1 金黄色葡萄球菌转录因子敲除体库的构建
            3.4.2 金黄色葡萄球菌敲除体的表型检测
            3.4.3 回补敲除基因抗性表型恢复
        3.5 讨论
        3.6 小结
    第四章 细胞壁连接酶Lcp C影响MRSA耐药性及致病性的研究
        4.1 试验材料
            4.1.1 菌株
            4.1.2 质粒
            4.1.3 引物及测序服务
            4.1.4 细胞系
            4.1.5 试剂
            4.1.6 主要仪器及设备
        4.2 试验原理及方法
            4.2.1 构建LcpC敲除菌株
            4.2.2 构建LcpC基因的原位回补菌株
            4.2.3 LcpC蛋白纯化及其多克隆抗体的制备与纯化
            4.2.4 LcpC敲除菌株耐药性的检测
            4.2.5 细胞粘附试验
            4.2.6 电镜观测LcpC敲除菌细胞壁的形态
            4.2.7 小鼠脓毒血症模型
            4.2.8 巨噬细胞炎症因子的检测
            4.2.9 实时定量PCR试验
            4.2.10 双分子荧光互补检测LcpC与其他蛋白间的相互作用
            4.2.11 统计分析方法
        4.3 试验结果
            4.3.1 LcpC菌株的敲除与回补
            4.3.2 LcpC蛋白纯化及抗体制备
            4.3.3 LcpC的敲除影响金黄色葡萄球菌对多种抗生素的耐药性
            4.3.4 LcpC的敲除影响金黄色葡萄球菌对细胞的粘附作用
            4.3.5 LcpC的敲除影响金黄色葡萄球菌的细胞壁形态
            4.3.6 Lcp C的敲除会降低MRSA对小鼠的致病性
            4.3.7 LcpC的敲除降低巨噬细胞的炎症因子表达水平
            4.3.8 Lcp C的敲除影响与细胞壁合成有关基因和细胞表面蛋白的m RNA水平
            4.3.9 荧光双分子互补试验验证与LcpC相互作用的蛋白
        4.4 讨论
        4.5 小结
    第五章 论文总结
        5.1 结论
        5.2 创新点
        5.3 研究展望
参考文献
附录
致谢
个人简历



本文编号：3649351