牛骨骼肌卫星细胞成肌分化相关miRNAs鉴定及功能研究

发布时间：2017-05-14 17:03

  本文关键词：牛骨骼肌卫星细胞成肌分化相关miRNAs鉴定及功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肌肉发育分化是发育生物学研究的重要内容,已有的研究表明miRNAs在肌肉发育和肌细胞增殖与分化中发挥了关键性的调控作用,而有关牛肌肉miRNAs及其参与肌肉生长发育和分化调控的研究还比较少。本研究拟分离培养牛骨骼肌卫星细胞,进行纯化和鉴定,建立体外成肌诱导分化模型,然后通过miRNA芯片筛选出肌卫星细胞分化前后差异表达的mi RNAs,real-time PCR验证芯片筛选结果,选出成肌分化相关miRNAs,利用生物信息学软件预测miRNAs的靶基因,并对靶基因进行进一步的功能分析,构建成肌分化相关miRNAs及其靶基因的调控网络。选择有代表性的成肌分化相关miRNAs,参考相关文献确认其靶基因,通过表达调控实验和双荧光素酶实验对靶基因进行验证,并选用miRNA mimics、miRNA inhibitors或构建真核表达载体转染牛肌卫星细胞上调或下调miRNAs的表达丰度,通过细胞增殖及分化检测,研究分化相关miRNAs对肌卫星细胞增殖和分化的调控作用。通过这些研究,系统地阐明肌卫星细胞与mi RNAs表达的相互作用机制,为肌细胞发育分化的miRNAs调控机制积累基础资料,并为肉牛新品种培育提供新的思路和有益的线索。1.本研究对牛骨骼肌卫星细胞进行体外分离培养、诱导分化和鉴定,采用胶原酶和胰酶联用的酶消化法分离肌卫星细胞,应用差速贴壁法进行纯化,观察卫星细胞及诱导分化后肌管的形态结构,并利用标志基因的反转录PCR(RT-PCR)和免疫荧光染色方法对分化前后细胞进行鉴定。结果显示分离出的肌卫星细胞呈梭形生长,生长状态良好,RT-PCR和免疫荧光染色显示肌卫星细胞Pax7和MyoD呈阳性表达,纯化后的肌卫星细胞纯度大于93%;诱导分化后,卫星细胞融合生长,形成的肌管状态良好,分化标志基因MyoG和MHC呈阳性表达。本研究建立了一套从牛肌肉组织中分离和鉴定肌卫星细胞的方法,可以为肌肉的发育分化和肉牛肉质改良研究提供良好的细胞模型。2.本研究对牛骨骼肌卫星细胞进行体外分离培养,研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对牛骨骼肌卫星细胞生长的影响,通过在生长和分化培养基中添加bFGF,观察细胞生长及分化情况,绘制细胞生长曲线并进行EdU细胞增殖检测实验,探讨bFGF对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响。研究结果表明无论在生长培养基或分化培养基中,添加bFGF都可以显著提高细胞增殖率,说明bFGF有明显的促进肌卫星细胞增殖的作用。本研究建立了一种高效的牛肌卫星细胞培养方案,可以为骨骼肌卫星细胞的研究利用提供参考。3.为了研究在牛肌卫星细胞成肌分化过程中miRNAs的表达模式和作用机制,本研究采用miRNAs芯片技术对牛肌卫星成肌分化过程中783个牛成熟miRNAs的表达模式进行检测,芯片筛选出了17个可信度较高的差异表达mirnas,进一步通过定量pcr技术对芯片分析结果进行验证,最终得到15个在肌卫星细胞成肌分化过程中显著差异表达的mirnas,其中12个上调表达,3个下调表达,上调的mirnas包括mir-1、mir-206、mir-128、mir-133a、mir-133b、mir-143、mir-145、mir-193b、mir-139、mir-378、mir-378b、mir-378c,下调的mirnas是mir-222、mir-335和mir-376e。4.进一步利用生物信息学分析方法对筛选出的成肌分化相关mirnas进行靶基因预测,总共预测出了3077个靶基因,其中有些靶基因已经被报道过在肌肉发育和分化中发挥了相应的作用,对靶基因进行了进一步的go和kegg分析,分析结果显示这些靶基因主要富集在转录调控、信号转导、蛋白转运、多细胞生物发育和细胞分化等有关的生物学过程中。kegg分析结果表明这些预测出的靶基因主要富集在mapk信号转导通路、神经突触传导、t细胞受体信号通路以及造血细胞通路等上面。研究结果表明,这些成肌分化相关mirnas可能在牛成肌分化过程中发挥了重要的调控作用。5.由于mir-1和mir-206具有相同的种子序列(5’端的2 8nt),推测它们可能调控相同或者相似的靶基因,因此在本部分研究中选择高表达且已有相关研究报道的mir-1和mir-206进行后续的功能验证工作,对其在牛骨骼肌卫星细胞增殖分化中的作用进行了研究。从mir-1和mir-206的靶基因中选择hdac4和pax7进行双荧光素酶调控实验,发现mir-1和mir-206可以与hdac4和pax7的3’utr结合而发挥调控作用,同时进行了在肌卫星细胞中的表达调控实验,包括过表达和抑制表达实验,rt-pcr和westernblot检测发现在未分化的状态下,mir-1和mir-206表达水平的变化可以影响hdac4和pax7的蛋白表达水平。进一步研究发现mir-1和mir-206可以调控牛骨骼肌卫星细胞的增殖和分化过程。过表达mir-1和mir-206抑制了肌卫星细胞的增殖,并促进了其成肌分化过程,而抑制表达则促进了卫星细胞的增殖并抑制其分化过程。本部分研究结果表明mir-1和mir-206可以通过调控pax7和hdac4的表达来促进牛肌卫星细胞的成肌分化过程。6.mir-1和mir-206在牛肌卫星细胞成肌分化中的功能验证进一步说明了前期芯片筛选结果的可靠性,接下来我们参考相关文献对筛选出的成肌分化相关mirnas进行了综合分析,对部分已有相关功能研究报道的mirnas,本研究不再进行深入的功能验证分析。接下来,我们对尚未见报道的mirnas进行了初步的研究分析,综合芯片分析结果,参考相关文献报道,并通过初步的靶基因筛选和验证工作,本研究进一步选择mir-139进行更深入的功能验证工作。因mir-139的靶基因主要作用于tgfβ、wnt、rho及mapk/pi3k等信号通路,综合分析后选择n-ras、tgfβ3和igf1r作为mir-139的靶基因进行后续的分析工作。研究结果表明,mir-139通过直接作用于igf1r和n-ras的3’-utr下调靶基因的表达水平。过表达mir-139抑制了成肌细胞增殖和分化,而抑制mir-139则促进了肌卫星细胞分化,同时对细胞增殖也具有一定的抑制作用。在mir-139对牛肌卫星细胞的增殖分化调控中,成肌细胞增殖主要是由mapk依赖的途径调控,而成肌细胞分化则主要是由PI3K/Akt依赖的途径调控的。过表达miR-139后,IGF1R和N-ras的蛋白表达水平下调,相应的p-Akt和p-ERK1/2水平也发生下调,p-ERK1/2水平下调抑制了细胞增殖,而p-Akt水平的下降抑制了成肌细胞的分化,这可能是miR-139过表达既抑制增殖又抑制分化的原因。抑制miR-139表达后,可以解除对IGF1R和N-ras抑制作用,p-Akt和p-ERK1/2水平上升,p-Akt水平的上升又引起了MyoD表达水平的升高,对肌卫星细胞的成肌分化起到了促进作用,而p-ERK1/2水平上升并未促进卫星细胞的增殖,可能是其作用被MyoD的促分化和抑制细胞周期的作用所掩盖。研究结果表明miR-139可以通过调控N-ras和IGF1R的表达,进而通过调控MAPK和PI3K/Akt信号通路来调控牛肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究揭示了mi R-139在肌卫星细胞增殖分化中的调控作用,失神经肌萎缩模型中的实验也表明mi R-139在体内也发挥了重要的调控作用,研究结果可以为骨骼肌的发育、肌损伤修复研究和牛肉质改良研究提供一定的参考。
【关键词】：牛 骨骼肌卫星细胞 miRNAs 成肌分化
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S823
【目录】：

• 摘要6-9
• ABSTRACT9-15
• 文献综述15-34
• 第一章 骨骼肌卫星细胞及肌肉发育分化的研究进展15-24
• 1.1 骨骼肌卫星细胞的生物学特性15-19
• 1.1.1 骨骼肌卫星细胞的发现15
• 1.1.2 骨骼肌卫星细胞的生物学特性15-18
• 1.1.3 骨骼肌卫星细胞的培养方法及研究进展18-19
• 1.2 骨骼肌卫星细胞在肌肉发育、分化及损伤修复中的作用19-21
• 1.2.1 骨骼肌的发生发育过程及影响因素19-20
• 1.2.2 骨骼肌卫星细胞在肌肉发育分化中的作用20
• 1.2.3 骨骼肌卫星细胞在肌损伤修复中的作用20-21
• 1.3 成肌调节因子MRFs对肌肉发育分化的影响21-22
• 1.3.1 MRFs的发现21
• 1.3.2 MRFs的结构与功能21
• 1.3.3 MRFs在肌肉发育分化中的作用21-22
• 1.4 小结与展望22-24
• 第二章 miRNAs的生物学特性及其对肌肉发育的影响24-34
• 2.1 miRNAs的发现24-25
• 2.2 miRNAs的生物合成、分布与表达特征25-27
• 2.3 miRNAs的作用机制及研究方法27-29
• 2.4 miRNAs在骨骼肌发育中的作用29-32
• 2.4.1 肌肉组织特异性miRNAs29-30
• 2.4.2 肌肉组织特异性miRNAs在肌肉发育中的作用30-31
• 2.4.3 非肌肉组织特异性miRNAs在肌肉发育中的作用31-32
• 2.5 小结与展望32-34
• 实验部分34-112
• 第三章 牛骨骼肌卫星细胞的分离鉴定和诱导分化34-46
• 3.1 材料和方法34-38
• 3.1.1 实验材料34-35
• 3.1.2 实验方法35-38
• 3.2 结果与分析38-43
• 3.2.1 牛肌卫星细胞的分离培养及诱导分化38-39
• 3.2.2 纯化方法和冷冻保存条件对牛肌卫星细胞的影响39-40
• 3.2.3 未分化牛肌卫星细胞的鉴定40-42
• 3.2.4 诱导分化后牛肌卫星细胞的鉴定42-43
• 3.3 讨论43-45
• 3.3.1 牛肌卫星细胞的分离培养43-44
• 3.3.2 牛肌卫星细胞的诱导分化44
• 3.3.3 牛肌卫星细胞的鉴定44-45
• 3.4 小结45-46
• 第四章 碱性成纤维细胞生长因子对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响46-54
• 4.1 材料与方法46-48
• 4.1.1 材料46-47
• 4.1.2 方法47-48
• 4.2 结果与分析48-52
• 4.2.1 生长培养基中添加bFGF对牛肌卫星细胞增殖的影响48-50
• 4.2.2 分化培养基中添加bFGF对牛肌卫星细胞增殖的影响50-52
• 4.3 讨论52-53
• 4.3.1 生长培养基中添加bFGF对牛肌卫星细胞增殖的影响52-53
• 4.3.2 分化培养基中添加bFGF对牛肌卫星细胞增殖的影响53
• 4.4 小结53-54
• 第五章 牛骨骼肌卫星细胞成肌分化相关miRNAs的鉴定和生物信息学分析54-70
• 5.1 材料与方法55-58
• 5.1.1 材料55
• 5.1.2 方法55-58
• 5.2 结果与分析58-66
• 5.2.1 牛肌卫星细胞成肌分化过程中差异表达mi RNAs的鉴定58-60
• 5.2.2 差异表达miRNAs的qRT-PCR验证60-61
• 5.2.3 成肌分化相关miRNAs的靶基因预测及功能网络分析61-66
• 5.3 讨论66-68
• 5.3.1 牛肌卫星细胞成肌分化过程中差异表达mi RNAs的鉴定66-67
• 5.3.2 成肌分化相关miRNAs的靶基因预测67-68
• 5.3.3 成肌分化相关miRNAs靶基因GO和KEGG分析68
• 5.4 小结68-70
• 第六章 miR-1/206对牛肌卫星细胞增殖分化的调控作用研究70-85
• 6.1 材料与方法71-74
• 6.1.1 材料71
• 6.1.2 方法71-74
• 6.2 结果与分析74-82
• 6.2.1 牛miR-1 和miR-206靶基因Pax7和HDAC4的双荧光素酶实验74-77
• 6.2.2 牛肌卫星细胞中Pax7和HDAC4基因的miR-1/206表达调控实验77-78
• 6.2.3 miR-1 和miR-206对牛肌卫星细胞增殖分化的调控作用78-82
• 6.3 讨论82-84
• 6.3.1 牛肌卫星细胞中Pax7和HDAC4基因的miR-1/206表达调控实验82-83
• 6.3.2 miR-1 和miR-206对牛肌卫星细胞增殖分化的调控作用83-84
• 6.4 小结84-85
• 第七章 miR-139对牛肌卫星细胞增殖分化的调控作用研究85-112
• 7.1 材料与方法87-92
• 7.1.1 材料87
• 7.1.2 方法87-92
• 7.2 结果与分析92-106
• 7.2.1 牛miR-139靶基因预测及双荧光素酶实验92-95
• 7.2.2 牛肌卫星细胞分化前后IGF1R基因和N-ras基因的表达变化95-96
• 7.2.3 牛肌卫星细胞中IGF1R基因和N-ras基因的mi R-139表达调控实验96-98
• 7.2.4 miR-139对牛肌卫星细胞增殖分化的调控作用98-101
• 7.2.5 miR-139对牛肌卫星细胞MAPK及PI3K/Akt信号通路的影响101-104
• 7.2.6 miR-139在失神经肌肉萎缩中的作用104-106
• 7.3 讨论106-110
• 7.3.1 miR-139对牛肌卫星细胞增殖分化的影响106-107
• 7.3.2 miR-139对牛肌卫星细胞MAPK和PI3K/Akt信号通路的调控作用107-110
• 7.4 小结110-112
• 结论112-114
• 创新之处和进一步研究课题114-115
• 参考文献115-131
• 附录131-135
• 致谢135-136
• 个人简介136

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