杨树同源重组特点及2n配子杂合性分析

发布时间：2017-05-16 01:02

  本文关键词：杨树同源重组特点及2n配子杂合性分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：基于未减数配子(2n配子)杂交的有性多倍化是产生植物多倍体的主要途径。同源重组则是不同类型2n配子杂合性差异的重要原因。同源重组及2n配子形成途径共同决定了2n配子的杂合性变化,进而影响异源多倍体的杂合性表现。开展植物同源重组特性以及2n配子杂合性研究,有效辨别三倍体种质来源以及不同来源的2n配子传递亲本杂合性差异等,对于促进林木多倍体育种理论基础研究以及2n配子有效利用具有重要意义。本研究在创建3个不同2n配子来源的‘哲引3号杨’(Populus pseudo-simonii × P. nigra var. italica'Zheyin-3')ב北京杨’(P.× beijingensis)全同胞异源三倍体群体以及二倍体对照群体的基础上,首次提出了一种高等植物同源重组产物异源双链DNA (heteroduplex DNA, hDNA)的检测策略,并依据该策略对母本‘哲引3号杨’的同源重组特点进行了剖析,进而依据染色体不同位点的同源重组信息筛选适宜标记位点,开展了2n配子形成途径鉴定以及不同形成途径的2n配子杂合性分析等。主要研究结果如下：(1)通过大孢子染色体加倍及胚囊染色体加倍建立了一套不同2n配子形成途径的全同胞杨树异源三倍体群体。其中,以‘哲引3号杨’雌花芽发育状态作为参照,在雌花芽状态处于芽鳞张开、花序微露时,即大孢子母细胞减数分裂处于双线期-终变期时施加高温41℃连续处理4 h诱导大孢子染色体加倍,获得来源于减数第一次分裂核复原(first-division restitution, FDR)和减数第二次分裂核复原(second-division restitution, SDR)的异源三倍体164株；同时,以‘哲引3号杨’雌蕊柱头最佳授粉时期作为起始参照点,对授粉后54-84h的‘哲引3号杨’雌花序施加高温41℃连续处理4h诱导胚囊染色体加倍,获得减数后分裂核复原(post-meiotic restitution, PMR)的异源三倍体94株。为开展2n配子来源鉴定与杂合性评价研究提供了材料基础。(2)提出了一种通过抑制杨树减数后分离(post-meiotic segreation, PMS)实现同源重组产物hDNA直接检测的新策略,首次从DNA水平实现了高等植物同源重组的直接检测。在减数分裂结束后的胚囊发育时期施加理化处理抑制染色体减数后分离,从而使携带同源重组产物hDNA的两条姐妹染色单体在胚囊发育的有丝分裂过程中不分离而共存于同一2n配子中；利用这种2n配子与异性正常配子交配,可以获得异源三倍体后代；最终采用共显性简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)分子标记对此来源的异源三倍体进行分析,从而确定同源重组产物hDNA产生与否。首次证明了杨树同源重组过程中的确有hDNA产生,实现了从DNA水平直接检测被子植物同源重组产物hDNA。该策略具有成本低廉、不需要高端复杂的技术手段以及适用于未测序物种等优点,为杨树等被子植物的同源重组机制研究开辟了一条新的研究途径。(3)基于提出的高等植物同源重组产物hDNA检测策略,首次揭示了杨树同源重组特性。研究结果表明,染色体上不同SSR标记位点处的hDNA频率不同,介于5.3%至76.6%之间；hDNA频率与检测位点距着丝粒间的距离存在显著性相关,与检测位点周围的重组率、甲基化程度、长末端重复(long terminal repeat, LTR)逆转录转座子以及低复杂性序列重复比率、转录本丰度等遗传因素间存在共变异,且与染色体物理长度间无关；发现‘哲引3号杨’大孢子母细胞减数分裂过程中有89.89%的染色体经历了1-3次重组事件,但与以往相关研究结果不同的是,有5.57%染色体经历了4-5次重组事件,有1条6号染色体经历了6次重组事件,如此高的同源重组次数可能与母本‘哲引3号杨’的高度杂合性有关。(4)提出了一种利用低重组率区域的SSR分子标记位点鉴定植物2n配子形成途径的分子检测策略,实现了FDR、SDR型2n配子的准确鉴别。针对大孢子发生存在不同步性导致FDR、SDR型2n配子来源的杨树异源三倍体难以辨别,以及同源重组影响2n配子形成途径判别准确性等问题,基于杨树同源重组特点分析,提出选取位于低重组率区域的SSR分子标记位点精确鉴定异源三倍体的2n配子发生途径的策略；进而采用筛选出的6个低重组率SSR分子标记对164株大孢子染色体加倍途径来源的异源三倍体进行分析,证明其中40株源自FDR型2n配子,124株源自SDR型2n配子。2n配子来源途径的准确判别为下一步开展不同类型2n配子杂合性评价及有效利用奠定了基础。(5)从群体水平分析了不同来源的青杨2n配子传递亲本杂合性特点,基于同源重组特点提出杨树杂合性分析的SSR分子标记引物综合选择策略。不同来源的2n配子杂合性分析结果显示,不同染色体传递亲本杂合度不同,其中经FDR型2n配子的不同染色体传递亲本杂合度的变异系数最低,为13.50%；而SDR及PMR型2n配子的相应变异系数分别为51.92%及63.14%,其原因在于FDR型2n配子只有1/2染色体受到同源重组影响的缘故；证明SDR及PMR型2n配子分别传递亲本的平均杂合度为39.58%及35.90%,而FDR型2n配子传递亲本的杂合度达到74.80%,显著高于SDR及PMR型2n配子。此外,基于同源重组特点分析,提出了一种适宜引物选择为主、引物随机选择为辅的引物综合选择策略,为今后杂合性分析中多态性标记位点的有效选择提供了依据。有关研究对于杨树以及其他物种植物2n配子的理论研究与高效利用具有重要意义。(6)针对一般认为传递亲本杂合性高的FDR型2n配子在育种中有较高的利用价值的观点提出不同的认识。从杨树同源重组的特点看,尽管SDR型、PMR型2n配子传递亲本的平均杂合度约为FDR型2n配子的一半,由于杨树hDNA频率与检测位点周围的转录本丰度间存在正相关关系,表明染色体交换产生的杂合位点多位于染色体基因密集区域,SDR型、PMR型2n配子在该染色体区域的决定具体目标性状的基因必然因同源重组而处于杂合状态,其在此区域传递的亲本杂合性可能反而更高,表明SDR及PMR型2n配子在育种中的利用价值不一定比FDR型2n配子低,三种类型的2n配子都应具有一定的利用价值。
【关键词】：杨树 异源三倍体 同源重组 hDNA 2n配子来源 FDR SDR PMR 鉴定 杂合性 策略
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S792.11
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-12
• 缩略词表12-13
• 目录13-16
• 引言16-18
• 1 文献综述18-34
• 1.1 植物同源重组研究进展18-23
• 1.1.1 基因连锁及同源重组的发现18-19
• 1.1.2 同源重组发生机制及其模型19-21
• 1.1.3 同源重组检测技术及其特点研究21-23
• 1.2 植物2n配子发生途径及其杂合性研究进展23-26
• 1.2.1 植物2n配子发生途径及其鉴定24-25
• 1.2.2 植物2n配子传递的杂合性研究25-26
• 1.3 问题与对策26-34
• 1.3.1 创新同源重组检测技术是准确鉴定植物2n配子的关键26-33
• 1.3.2 从群体水平入手是科学、准确评价2n配子的前提33-34
• 2 杨树2n雌配子诱导与异源三倍体群体的建立34-42
• 2.1 材料与方法34-36
• 2.1.1 研究材料及其来源34-35
• 2.1.2 实验方法35-36
• 2.1.2.1 大孢子染色体加倍35-36
• 2.1.2.2 胚囊染色体加倍36
• 2.1.2.3 子代植株倍性水平检测36
• 2.2 结果与分析36-39
• 2.2.1 大孢子染色体加倍诱导青杨异源三倍体37-38
• 2.2.2 胚囊染色体加倍诱导青杨异源三倍体38-39
• 2.3 小结39-42
• 3 杨树同源重组检测方法及其特点研究42-60
• 3.1 材料与方法42-45
• 3.1.1 实验材料42-43
• 3.1.2 实验方法43-45
• 3.1.2.1 基因组DNA的提取43
• 3.1.2.2 基因组DNA质量的检测43-44
• 3.1.2.3 荧光标记的TP-M13-SSR PCR44
• 3.1.2.4 多态性引物的筛选44-45
• 3.1.2.5 统计分析45
• 3.2 结果与分析45-58
• 3.2.1 高等植物同源重组检测方法的提出45-48
• 3.2.2 高等植物同源重组检测方法的验证48-53
• 3.2.3 杨树同源重组特点研究53-58
• 3.2.3.1 杨树hDNA发生频率及其特点53-57
• 3.2.3.2 杨树同源重组事件发生的次数57-58
• 3.3 小结58-60
• 4 杨树2n配子发生途径的分子标记鉴定60-70
• 4.1 材料与方法60-61
• 4.1.1 实验材料60-61
• 4.1.2 DNA提取及TP-M13-SSR PCR61
• 4.2 结果与分析61-68
• 4.2.1 适于2n配子形成途径鉴定的SSR引物筛选61-63
• 4.2.2 大孢子染色体加倍来源的杨树三倍体形成途径鉴定63-66
• 4.2.3 引物的选择对三倍体形成途径分析的影响66-68
• 4.3 小结68-70
• 5 杨树不同来源2n配子杂合性分析70-88
• 5.1 材料与方法70-71
• 5.1.1 实验材料70
• 5.1.2 实验方法70-71
• 5.1.2.1 DNA提取及TP-M13-SSR PCR71
• 5.1.2.2 杨树不同来源2n配子的杂合性分析71
• 5.1.2.3 统计分析71
• 5.2 结果与分析71-85
• 5.2.1 杨树不同来源2n配子的杂合性分析71-78
• 5.2.1.1 用于2n配子杂合性分析的多态性SSR引物的筛选71-76
• 5.2.1.2 杨树不同来源的2n配子的杂合性分析76-78
• 5.2.2 多态性SSR引物选择策略分析78-84
• 5.2.2.1 引物有序选择策略78-80
• 5.2.2.2 引物随机选择策略80-82
• 5.2.2.3 适宜引物选择策略82-84
• 5.2.3 SSR引物评价与引物综合选择策略84-85
• 5.3 小结85-88
• 6 讨论88-96
• 6.1 有关高等植物hDNA的检测方法88-89
• 6.2 杨树hDNA发生及同源重组特点89-91
• 6.3 杨树2n配子来源鉴定及其传递亲本杂合性分析91-93
• 6.4 杨树多倍体育种策略93-96
• 7 结论96-98
• 参考文献98-108
• 个人简介108-110
• 成果清单110-112
• 导师简介112-114
• 致谢114-11

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