稻绿核菌UV-2中二萘并-γ-吡喃酮的分离鉴定、制备工艺及其生物活性

发布时间：2017-05-16 18:16

  本文关键词：稻绿核菌UV-2中二萘并-γ-吡喃酮的分离鉴定、制备工艺及其生物活性，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：稻曲病(False smut of rice)是一种严重危害水稻的真菌病害,不仅造成水稻减产,还产生两类为害人畜安全的真菌毒素,直接影响水稻的食用安全。其病原菌为稻绿核菌,侵染水稻穗部形成稻曲球。从稻曲球中分离得到的次生代谢产物主要分为两类,一类为稻曲菌素。另一类为稻绿核菌素,属于二萘并γ-吡喃酮类化合物。二萘并-γ-吡喃酮具有多种生物活性：如对小鼠胚胎肢芽和中脑细胞具有致畸作用；对人表皮癌细胞(KB)的细胞毒活性；线粒体的损伤作用；HIV-1整合酶抑制活性；抗菌活性和免疫抑制活性等。研究稻绿核菌素的种类及其活性对于该类化合物的开发与利用,生物合成途径,以及稻曲病的防治具有重要意义。从稻曲病菌发酵培养物中分离鉴定稻绿核菌素及其生物活性尚未见报道。本文以稻绿核菌UV-2为研究对象,重点对稻绿核菌的次生代谢产物、生物活性以及制备工艺进行了研究,主要结果如下：1、从稻绿核菌UV-2的大米固体发酵物中分离并鉴定13个稻绿核菌素,均属于二萘并-γ-吡喃酮类型。其中7个为新的化合物,包括Ustilaginoidins K-P和Ustilaginoidin E1;6个为已知化合物,为Ustilaginoidins A、D、E、F、G及Isochaetochromin B2。2、活性研究表明,Ustilaginoidin K和Ustilaginoidin L对卵巢癌细胞A2780具有显著的抑制作用(IC50分别为4.18和7.26μM)。Ustilaginoidin N、Ustilaginoidin D、Ustilaginoidin E和Ustilaginoidi G对供试细菌表现出较强的抑制活性。此外,本研究首次报道了二萘并-γ-吡喃酮这一类型化合物对水稻种子的植物毒活性,其中Ustilaginoidins O、E、F和Isochaetochromin B2对水稻种子胚根的生长表现出一定的抑制活性。3、采用高速逆流色谱(HSCCC)分离制备的方法结合半制备型高效液相色谱对6个稻绿核菌素进行了快速制备。经过一步制备型HSCCC便可从对稻绿核菌提取物中分离纯化中4个稻绿核菌素,包括Ustilaginoidin G、Ustilaginoidin E、Ustilaginoidin M和Ustilaginoidin D,纯度最高可达90%以上。再经过一步半制备型高校液相色谱又可得到化合物Ustilaginoidin N和Ustilaginoidin O.4、采用大孔吸附树脂对稻绿核菌素Ustilaginoidins D-O的富集条件进行了摸索。从7种不同的大孔吸附树脂中筛选出树脂HP-20。通过动态吸附和解吸附实验,建立了大孔吸附树脂HP-20对Ustilaginoidins D-O的最佳吸附条件为：上样体积约为24 BV,流速3 BV/h,样品溶液的初始pH值为4；最佳解吸附条件为：60%的丙酮溶液,解析体积约为4.5 BV,流速3 BV/h。5、采用2种抗氧化模型对稻绿核菌UV-2菌丝水提多糖(WPS)、菌丝碱提多糖(SPS)和胞外多糖(EPS)的抗氧化活性进行了评价,其中EPS表现出较好的抗氧化活性。为了有效提高发酵培养中EPS的得率,采用中心组合实验和响应面分析,当培养基中葡萄糖的浓度为84.08 g/L,蛋白胨为14.11g/L时,EPS得率达到最大值,为881.40 mg/L。通过模型预测出的最佳培养基进行实验验证(n=5),得到EPS得率的实验值为917.8 mg/L,较未优化前提高了9.6倍。本论文研究结果为稻绿核菌素的生物合成途径、代谢调控、检测和分析、代谢组学等后续研究提供依据,在应用上将为活性物质的开发和应用,以及稻曲病的防治提供基础。
【关键词】：稻曲病 稻绿核菌 二萘并-γ-吡喃酮 稻绿核菌素 真菌毒素 真菌多糖 高速逆流色谱 大孔吸附树脂 抗氧化活性 植物毒活性 细胞毒活性
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S435.11
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• Abbreviation8-13
• 第1章 前言13-52
• 1.1 二萘并-γ-吡喃酮真菌及其生物活性13-36
• 1.1.1 二萘并-γ-吡喃酮的分布与结构13-26
• 1.1.2 二萘并-γ-吡喃酮的生物合成26-30
• 1.1.3 二萘并-γ-吡喃酮的生物活性30-35
• 1.1.4 展望35-36
• 1.2 真菌多糖的来源及其生物活性研究进展36-50
• 1.2.1 多糖的来源36
• 1.2.2 真菌多糖的生物活性36-49
• 1.2.3 展望49-50
• 1.3 论文设计50-52
• 1.3.1 立题依据50
• 1.3.2 研究目的和意义50
• 1.3.3 研究内容50
• 1.3.4 技术路线50-52
• 第2章 稻绿核菌UV-2中稻绿核菌素的分离鉴定及生物活性52-87
• 2.1 材料与方法52-56
• 2.1.1 菌株材料52
• 2.1.2 仪器设备与试剂52
• 2.1.3 培养基52-53
• 2.1.4 稻绿核菌UV-2提取物的制备53
• 2.1.5 化合物的分离53-54
• 2.1.6 抗菌活性测定54-55
• 2.1.7 植物毒活性的测定55-56
• 2.1.8 细胞毒活性的测定56
• 2.2 结果与分析56-85
• 2.2.1 化合物的结构鉴定56-82
• 2.2.2 化合物的抗菌活性测定82-83
• 2.2.3 化合物的植物毒活性的测定83-84
• 2.2.4 化合物的细胞毒活性的测定84-85
• 2.3 本章小结85-87
• 第3章 采用高速逆流色谱制备主要的稻绿核菌素87-95
• 3.1 材料与方法87-90
• 3.1.1 菌株材料87
• 3.1.2 仪器设备与试剂87
• 3.1.3 稻绿核菌素UV-2提取物的制备87
• 3.1.4 高速逆流色谱法制备六种稻绿核菌素87-90
• 3.2 结果与分析90-94
• 3.2.1 溶剂系统的选择90-91
• 3.2.2 HSCCC对稻绿核菌素的分离制备91-94
• 3.3 本章小结94-95
• 第4章 大孔吸附树脂对稻绿核菌素的纯化工艺95-106
• 4.1 材料与方法95-98
• 4.1.1 仪器与设备95
• 4.1.2 粗提物的制备95
• 4.1.3 稻绿核菌素的定量分析95-96
• 4.1.4 大孔吸附树脂的预处理96
• 4.1.5 大孔吸附树脂的筛选96-97
• 4.1.6 大孔吸附树脂HP-20静态吸附曲线的测定97
• 4.1.7 样品溶液的初始pH值对大孔吸附树脂HP-20吸附性能的影响97
• 4.1.8 大孔吸附树脂HP-20的动态吸附和解吸实验97-98
• 4.2 结果与分析98-105
• 4.2.1 大孔吸附树脂的筛选98
• 4.2.2 大孔吸附树脂HP-20静态吸附动力学98-101
• 4.2.3 样品溶液的初始pH值对大孔吸附树脂HP-20吸附性能的影响101
• 4.2.4 洗脱溶剂对大孔吸附树脂HP-20解析性能的影响101-102
• 4.2.5 丙酮浓度对大孔吸附树脂HP-20解析性能的影响102-103
• 4.2.6 大孔吸附树脂HP-20动态吸附穿透曲线103-104
• 4.2.7 大孔吸附树脂HP-20动态吸附解吸曲线104-105
• 4.3 本章小结105-106
• 第5章 稻绿核菌UV-2胞外多糖抗氧化活性及培养基优化106-118
• 5.1 材料与方法106-110
• 5.1.1 实验材料106
• 5.1.2 主要仪器和试剂106
• 5.1.3 多糖的制备106-107
• 5.1.4 多糖含量的测定107
• 5.1.5 多糖抗氧化活性评价107-108
• 5.1.6 Plack-Burman实验108-109
• 5.1.7 单因素实验109
• 5.1.8 中心组合实验109-110
• 5.1.9 统计分析110
• 5.2 结果与分析110-117
• 5.2.1 多糖的制备110-111
• 5.2.2 多糖的抗氧化活性111
• 5.2.3 培养基的优化生产胞外多糖111-117
• 5.3 本章小结117-118
• 第6章 结论与展望118-123
• 6.1 结论118-119
• 6.2 讨论119-120
• 6.3 二萘并-γ-吡喃酮谱图规律总结120-121
• 6.4 创新点121
• 6.5 不足之处121
• 6.6 展望121-123
• 参考文献123-144
• 附录144-180
• 化合物Ustilaginoidin K的波谱图144-148
• 化合物Ustilaginoidin K的HR-ESI-MS谱图144-145
• 化合物Ustilaginoidin K的IR谱图145
• 化合物Ustilaginoidin K的~1H-NMR谱图(CD_3COCD_3,600 MHz)145-146
• 化合物Ustilaginoidin K的~(13)C-NMR谱图(CD_3COCD_3,150 MHz)146
• 化合物Ustilaginoidin K的HMQC谱图(CD_3COCD_3-d_6)146-147
• 化合物Ustilaginoidin K的HMBC谱图(CD_3COCD_3-d_6)147
• 化合物Ustilaginoidin K的CD谱图(DMSO-d_6)147-148
• 化合物Ustilaginoidin L的波谱图148-151
• 化合物Ustilaginoidin L的HR-ESI-MS谱图148
• 化合物Ustilaginoidin L的IR谱图148-149
• 化合物Ustilaginoidin L的~1H-NMR谱图(CD_3COCD_3,600 MHz)149
• 化合物Ustilaginoidin L的~(13)C-NMR谱图(CD_3COCD_3,100 MHz)149-150
• 化合物Ustilaginoidin L的HMQC谱图(CD_3COCD_3-d_6)150
• 化合物Ustilaginoidin L的HMBC谱图(CD_3COCD_3-d_6)150-151
• 化合物Ustila.ginoidin L的CD谱图(DMSO-d_6)151
• 化合物Ustilaginoidin M的波谱图151-154
• 化合物Ustilaginoidin M的HR-ESI-MS谱图151-152
• 化合物Ustilaginoidin M的R谱图152
• 化合物Ustilaginoidin M的~1H-NMR谱图(CD_3COCD_3,600 MHz)152-153
• 化合物Ustilaginoidin M的~(13)C-NMR谱图(CD_3COCD_3,100 MHz)153
• 化合物Ustilaginoidin M的CD谱图(DMSO-d_6)153-154
• 化合物Ustilaginoidin N的波谱图154-157
• 化合物Ustilaginoidin N的HR-ESI-MS谱图154
• 化合物Ustilaginoidin N的IR谱图154-155
• 化合物Ustilaginoidin N的~1H-NMR谱图(CD_3COCD_3,400 MHz)155
• 化合物Ustilaginoidin N的~(13)C-NMR谱图(CD_3COCD_3,100 MHz)155-156
• 化合物Ustilaginoidin N的HMQC谱图(CD_3COCD_3-d_6)156
• 化合物Ustilaginoidin N的HMBC谱图(CD_3COCD_3-d_6)156-157
• 化合物Ustilaginoidin N的CD谱图(DMSO-d_6)157
• 化合物Ustilaginoidin O的波谱图157-162
• 化合物Ustilaginoidin O的HR-ESI-MS谱图157-158
• 化合物Ustilaginoidin O的IR谱图158-159
• 化合物Ustilaginoidin O的~1H-NMR谱图(CD_3COCD_3,600 MHz)159
• 化合物Ustilaginoidin O的~(13)C-NMR谱图(CD_3COCD_3,150 MHz)159-160
• 化合物Ustilaginoidin O的HMQC谱图(CD_3COCD_3-d_6)160-161
• 化合物Ustilaginoidin O的HMBC谱图(CD_3COCD_3-d_6)161-162
• 化合物Ustilaginoidin O的CD谱图(DMSO-d_6)162
• 化合物Ustilaginoidin P的波谱图162-165
• 化合物Ustilaginoidin P的HR-ESI-MS谱图162-163
• 化合物Ustilaginoidin P的IR谱图163
• 化合物Ustilaginoidin P的~1H-NMR谱图(CD_3COCD_3,600 MHz)163-164
• 化合物Ustilaginoidin P的~(13)C-NMR谱图(CD_3COCD_3,150 MHz)164
• 化合物Ustilaginoidin P的CD谱图(DMSO-d_6)164-165
• 化合物Ustilaginoidin E_1的波谱图165-167
• 化合物Ustilaginoidin E_1的HR-ESI-MS谱图165
• 化合物Ustilaginoidin E_1的IR谱图165-166
• 化合物Ustilaginoidin E_1的~1H-NMR谱图(CD_3COCD_3,600 MHz)166
• 化合物Ustilaginoidin E_1的~(13)C-NMR谱图(CD_3COCD_3,150 MHz)166-167
• 化合物Ustilaginoidin E_1的CD谱图(DMSO-d_6)167
• 化合物Ustilaginoidin A的波谱图167-169
• 化合物Ustilaginoidin A的HR-ESI-MS谱图167-168
• 化合物Ustilaginoidin A的~1H-NMR谱图(CD_3COCD_3,400 MHz)168
• 化合物Ustilaginoidin A的~(13)C-NMR谱图(CD_3COCD_3,100 MHz)168-169
• 化合物Ustilaginoidin A的CD谱图(DMSO-d_6)169
• 化合物Ustilaginoidin D的波谱图169-171
• 化合物Ustilaginoidin D的HR-ESI-MS谱图169-170
• 化合物Ustilaginoidin D的~1H-NMR谱图(CD_3COCD_3,400 MHz)170
• 化合物Ustilaginoidin D的~(13)C-NMR谱图(CD_3COCD_3,100 MHz)170-171
• 化合物Ustilaginoidin D的CD谱图(DMSO-d_6)171
• 化合物Ustilaginoidin E的波谱图171-173
• 化合物Ustilaginoidin E的HR-ESI-MS谱图171-172
• 化合物Ustilaginoidin E的~1H-NMR谱图(CD_3COCD_3,400 MHz)172
• 化合物Ustilaginoidin E的~(13)C-NMR谱图(CD_3COCD_3,100 MHz)172-173
• 化合物Ustilaginoidin E的CD谱图(DMSO-d_6)173
• 化合物Ustilaginoidin F的波谱图173-175
• 化合物Ustilaginoidin F的HR-ESI-MS谱图173-174
• 化合物Ustilaginoidin F的~1H-NMR谱图(CD_3COCD_3,400 MHz)174
• 化合物Ustilaginoidin F的~(13)C-NMR谱图(CD_3COCD_3,100 MHz)174-175
• 化合物Ustilaginoidin F的CD谱图(DMSO-d_6)175
• 化合物Ustilaginoidin G的波谱图175-177
• 化合物Ustilaginoidin G的HR-ESI-MS谱图175-176
• 化合物Ustilaginoidin G的~1H-NMR谱图(CD_3COCD_3,400 MHz)176
• 化合物Ustilaginoidin G的~(13)C-NMR谱图(CD_3COCD_3,100 MHz)176-177
• 化合物Ustilaginoidin G的CD谱图(DMSO-d_6)177
• 化合物Isochaetochromin B_2的波谱图177-180
• 化合物Isochaetochromin B_2的HR-ESI-MS谱图177-178
• 化合物Isochaetochromin B_2的~1H-NMR谱图(CD_3COCD_3,400 MHz)178
• 化合物Isochaetochromin B_2的~(13)C-NMR谱图(CD_3COCD_3,100 MHz)178-179
• 化合物Isochaetochromin B_2的CD谱图(DMSO-d_6)179-180
• 致谢180-181
• 个人简历181

  本文关键词：稻绿核菌UV-2中二萘并-γ-吡喃酮的分离鉴定、制备工艺及其生物活性，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：371575