Luman在小鼠颗粒细胞和子宫内膜基质细胞功能调节中的作用研究

发布时间：2022-12-22 02:45

　　Luman又称CREB3或LZIP,属于基础亮氨酸拉链（basic leucine-zipper,bZIP）转录因子。在结构上它与转录激活因子6（Activating transcription factor 6,ATF6）相似,具有跨膜结构域,能够与内质网膜结合,且同时具有转录激活结构域和bZIP结构域。Luman广泛表达于动物的多种组织器官,在雌性小鼠的卵巢、输卵管和子宫中以及雄性小鼠的睾丸间质细胞和精子中均有Luman的表达。研究表明,在雌性小鼠卵巢和子宫中Luman的表达随着发情周期呈现规律性变化,且Luman干扰后雌性小鼠母性下降且产仔数下降,因此Luman可能在卵巢功能以及早期妊娠过程中起到重要作用。本研究利用RNAi干扰技术,实时荧光定量PCR,western blot,细胞免疫荧光技术,CCK-8细胞计数,ELISA和流式细胞术,对Luman在卵巢和子宫中颗粒细胞及子宫内膜基质细胞功能调节中的作用进行研究。得到以下结果:1.设计3对针对Luman基因的干扰片段,并分别构建其慢病毒干扰载体pCD513B-U6-Luman 1、2、3。将3对目的载体分别和包装质粒一起转染2... 

【文章页数】：106 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
abstract
文献综述
    第一章 卵泡发育与胚胎附植的调节
        1.1 卵泡发育以及闭锁的调节
            1.1.1 卵泡发育的调节
            1.1.2 卵泡闭锁的调节
        1.2 子宫内膜基质细胞蜕膜化的研究
            1.2.1 胚胎附植
            1.2.2 蜕膜化的调节
        1.3 类固醇激素与胚胎附植
            1.3.1 雌激素合成及其调节作用
            1.3.2 孕激素合成及其调节作用
        1.4 环境雌激素类似物对雌性动物生殖的影响
            1.4.1 环境中的雌激素类似物
            1.4.2 双酚A
            1.4.3 双酚A对雌性动物生殖的影响
        1.5 内质网应激研究进展
            1.5.1 内质网应激概况
            1.5.2 内质网应激与细胞凋亡反应
            1.5.3 内质网应激与雌性哺乳动物生殖
        1.6 Luman研究进展
            1.6.1 CREB3蛋白家族
            1.6.2 Luman的功能
            1.6.3 Luman与雌性哺乳动物生殖
试验研究
    第二章 小鼠Luman基因shRNA慢病毒载体构建和病毒包装
        2.1 材料及仪器
            2.1.1 主要试剂
            2.1.2 主要仪器
        2.2 方法
            2.2.1 小鼠Luman基因慢病毒载体的构建
            2.2.2 shLuman干扰慢病毒的包装
            2.2.3 shLuman干扰慢病毒滴度测定
            2.2.4 shLuman干扰片段的筛选
        2.3 结果与分析
            2.3.1 Luman慢病毒干扰载体的鉴定
            2.3.2 shLuman干扰慢病毒包装
            2.3.3 shLuman干扰慢病毒滴度测定
            2.3.4 shLuman干扰慢病毒转导NIH3T3细胞
            2.3.5 shLuman慢病毒干扰效率筛选
        2.4 讨论
        2.5 小结
    第三章 干扰Luman对小鼠颗粒细胞功能的影响
        3.1 材料及仪器
            3.1.1 主要试剂
            3.1.2 主要仪器
            3.1.3 实验动物
        3.2 方法
            3.2.1 实验小鼠的超数排卵
            3.2.2 小鼠颗粒细胞体外培养
            3.2.3 慢病毒的包装
            3.2.4 shLuman干扰慢病毒在颗粒细胞中干扰效率的检测
            3.2.5 颗粒细胞全蛋白提取和western blot检测
            3.2.6 颗粒细胞RNA提取和RT-qPCR检测
            3.2.7 细胞免疫荧光
            3.2.8 ELISA检测小鼠颗粒细胞E2和P4的分泌
            3.2.9 流式细胞术检测颗粒细胞周期
            3.2.10 流式细胞术检测颗粒细胞凋亡
        3.3 结果与分析
            3.3.1 原代小鼠颗粒细胞的分离培养
            3.3.2 慢病毒转导小鼠颗粒细胞效率检测
            3.3.3 总RNA质量鉴定
            3.3.4 shLuman慢病毒转导颗粒细胞干扰效率检测
            3.3.5 干扰Luman对小鼠颗粒细胞激素分泌以及相关因子的影响
            3.3.6 干扰Luman对小鼠颗粒细胞周期以及相关因子的影响
            3.3.7 干扰Luman对小鼠颗粒细胞凋亡以及相关因子的影响
            3.3.8 干扰Luman对小鼠颗粒细胞功能的影响
        3.4 讨论
        3.5 小结
    第四章 Luman干扰后小鼠子宫内细胞蜕膜化差异基因的筛选
        4.1 材料及仪器
            4.1.1 主要试剂
            4.1.2 主要仪器
            4.1.3 实验动物
        4.2 方法
            4.2.1 小鼠合笼处理
            4.2.2 小鼠原代子宫内膜基质细胞的分离与培养
            4.2.3 细胞免疫荧光检测
            4.2.4 shLuman慢病毒转导原代基质细胞并对其进行体外诱导蜕膜化
            4.2.5 转录组测序及分析
            4.2.6 Luman直接调控基因的鉴定
        4.3 结果与分析
            4.3.1 小鼠原代子宫内膜基质细胞的分离与培养
            4.3.2 小鼠原代子宫内膜基质细胞纯度鉴定
            4.3.3 小鼠原代子宫内膜基质细胞的体外诱导蜕膜化
            4.3.4 小鼠原代子宫内膜基质细胞体外成功诱导蜕膜化的鉴定
            4.3.5 Luman在体外诱导蜕膜化的基质细胞中的表达
            4.3.6 shLuman慢病毒转导原代基质细胞干扰效率鉴定
            4.3.7 shLuman慢病毒转导基质细胞对蜕膜化的影响
            4.3.8 干扰Luman,蜕膜基质细胞转录组变化
            4.3.9 RNA-seq数据的验证
            4.3.10 干扰Luman对蜕膜化基质细胞内质网应激相关基因的影响
            4.3.11 干扰Luman对基质细胞蜕膜化功能相关基因表达的影响
            4.3.12 干扰Luman对蜕膜化基质细胞周期的影响
            4.3.13 Luman对蜕膜化基质细胞作用信号通路分析
            4.3.14 Luman调控基因的预测
        4.4 讨论
        4.5 小结
    第五章 Luman在BPA影响蜕膜细胞功能变化中的调节作用
        5.1 材料及仪器
            5.1.1 主要试剂
            5.1.2 主要仪器
            5.1.3 实验动物
        5.2 方法
            5.2.1 小鼠子宫内膜基质细胞的分离、培养以及体外蜕膜诱导
            5.2.2 BPA对小鼠子宫内膜基质细胞活力的影响
            5.2.3 BPA处理蜕膜细胞
            5.2.4 shLuman慢病毒转导小鼠子宫内膜蜕膜细胞
        5.3 结果与分析
            5.3.1 BPA对小鼠子宫内膜蜕膜细胞活力的影响
            5.3.2 BPA对基质细胞增殖的影响
            5.3.3 BPA对蜕膜细胞功能的影响
            5.3.4 BPA对蜕膜细胞中内质网应激相关基因的的影响
            5.3.5 BPA对蜕膜细胞中Luman表达的影响
            5.3.6 Luman干扰效率检测
            5.3.7 干扰Luman后BPA对蜕膜功能的影响
        5.4 讨论
        5.5 小结
结论
创新点
下一步研究计划
参考文献
致谢
作者简介



本文编号：3723286