拟穴青蟹胚胎和幼体发育期分子免疫基础及幼体对病原感染的免疫应答

发布时间：2023-01-31 06:54

　　1、本项研究所采用的青蟹样本是成熟青蟹卵巢,抱卵蟹上采集的各期青蟹胚胎样品,以及孵化后的幼体,包括胚胎阶段的各期（Eml胚胎期、Em2胚胎期、Em3胚胎期、Em4胚胎期和Em5胚胎期）、幼体各期（溞状Ⅰ期、搔状Ⅱ期、溞状Ⅲ期、溞状Ⅳ期、溞状Ⅴ期、大眼幼体和仔蟹Ⅰ期）。对溞状Ⅰ期、大眼幼体和仔蟹Ⅰ期进行了 LPS刺激和解藻弧菌感染的研究,并采集样品。2、本研究首先利用各胚胎发育期和溞状幼体Ⅰ期样本建立了 一个转录组库,然后在此转录组库的基础上,通过数字表达谱技术对青蟹发育早期差异表达基因进行了研究,共得到9.42 G数据量,其中拼接得到116,370条transcripts及77,643条unigenes。通过NR数据库注释16,170条基因（占全部注释基因的20.82%）,PFAM数据库注释18,556条基因（占全部注释基因的23.89%）,GO数据库注释19,164条基因（占全部注释基因的24.68%）。3、对各胚胎发育期和溞状幼体Ⅰ期样品进行蛋白质组测序,利用iTRAQ技术进行蛋白质相对定量,共得到谱图338,059张,通过Mascot软件进行分析后,匹配到的谱图数量是16,362... 

【文章页数】：482 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
缩略词中英文对照表
第1章 绪论
    1.1 前言
    1.2 拟穴青蟹早期发育的研究
        1.2.1 拟穴青蟹胚胎及幼体阶段发育史
        1.2.2 拟穴青蟹早期发育过程中重要的生物学过程
        1.2.3 拟穴青蟹胚胎及幼体阶段研究进展
    1.3 甲壳动物先天性免疫
        1.3.1 模式识别受体PRRs
        1.3.2 抗菌肽
        1.3.3 Toll通路
        1.3.4 IMD通路
        1.3.5 Jak/Stat 通路
        1.3.6 酚氧化酶原系统
        1.3.7 补体系统
        1.3.8 凝血系统
    1.4 组学在甲壳动物中的研究进展
        1.4.1 转录组介绍
        1.4.2 蟹类转录组的研究
        1.4.3 海洋动物不同发育时期的转录组研究
        1.4.4 蛋白质组介绍
        1.4.5 蟹类蛋白质组的研究
        1.4.6 海洋动物不同发育时期的蛋白质组研究
    1.5 研究技术路线、目的和意义
        1.5.1 研究目的和意义
        1.5.2 研究技术路线
第2章 拟穴青蟹胚胎各发育时期和幼体各发育时期的转录组测序及分析
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验动物
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 拟穴青蟹人工繁育及胚胎幼体样品采集
        2.2.2 不同发育时期的显微镜观察
        2.2.3 总RNA提取
        2.2.4 转录组文库构建
        2.2.5 测序及拼接
        2.2.6 差异基因表达量分析及基因功能注释和分析
    2.3 结果
        2.3.1 实验样品
        2.3.2 转录组数据建库、拼接及注释
        2.3.3 qPCR验证
        2.3.4 转录组分析结果
    2.4 讨论
        2.4.1 拟穴青蟹胚胎至仔蟹Ⅰ期不同发育阶段先天性免疫的基础研究
        2.4.2 青蟹胚胎和幼体发育阶段高表达的基因
        2.4.3 青蟹潜在的母源因子
        2.4.4 青蟹溞状幼体孵出过程中的免疫相关基因变化特点
        2.4.5 自然状态下的青蟹早期各发育阶段中抗菌肽表达情况
        2.4.6 自然状态下青蟹早期各发育阶段中Toll信号通路和IMD通路的表达情况
        2.4.7 自然状态下青蟹早期各发育阶段中酚氧化酶原系统的表达情况
        2.4.8 自然状态下青蟹早期各发育阶段中激素的表达情况
        2.4.9 小结
第3章 拟穴青蟹胚胎发育时期和幼体发育时期的蛋白质组测序及分析
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验动物
    3.2 实验方法
        3.2.1 拟穴青蟹人工繁育及胚胎幼体样品采集
        3.2.2 iTRAQ实验方法
    3.3 结果
        3.3.1 蛋白质组学建库
        3.3.2 蛋白质组学注释
        3.3.3 差异蛋白的筛选
        3.3.4 差异蛋白的富集分析
        3.3.5 免疫相关差异蛋白分析
        3.3.6 蛋白质组与转录组的关联分析
    3.4 讨论
        3.4.1 青蟹蛋白质组学研究的局限性
        3.4.2 青蟹早期发育关键阶段的差异蛋白
        3.4.3 青蟹胚胎早期发育阶段Em1至Em2期差异表达的免疫相关蛋白
        3.4.4 青蟹孵化为溞状幼体阶段差异表达的免疫相关蛋白
        3.4.5 青蟹胚胎发育阶段差异表达的酚氧化酶原系统相关蛋白
        3.4.6 青蟹胚胎发育期的蛋白质组学与转录组学的相关性分析
第4章 LPS刺激和解藻弧菌感染下拟穴青蟹溞状幼体Ⅰ期、大眼幼体和仔蟹Ⅰ期的转录组分析及其相关免疫因子特性分析
    4.1 实验材料
        4.1.1 实验动物
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 主要仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 青蟹幼体的解藻弧菌或LPS攻毒试验
        4.2.2 总RNA提取
        4.2.3 文库构建
        4.2.4 测序及拼接
        4.2.5 基因功能注释及分析
    4.3 结果
        4.3.1 溞状幼体Ⅰ期、大眼幼体和仔蟹Ⅰ期LPS刺激或解藻弧菌感染样本的转录组数据质量分析
        4.3.2 溞状幼体Ⅰ期LPS刺激或解藻弧菌感染样本的转录组数据分析
        4.3.3 大眼幼体LPS刺激或解藻弧菌感染样本的转录组数据分析
        4.3.4 仔蟹Ⅰ期LPS刺激或解藻弧菌感染样本的转录组数据分析
    4.4 讨论
        4.4.1 解藻弧菌感染下溞状幼体Ⅰ期、大眼幼体及仔蟹Ⅰ期的转录组分析
        4.4.2 LPS下溞状幼体Ⅰ期、大眼幼体及仔蟹Ⅰ期的转录组分析
        4.4.3 LPS和解藻弧菌感染下溞状幼体Ⅰ期、大眼幼体及仔蟹Ⅰ期的转录组数据的比较研究
        4.4.4 病原感染下溞状幼体Ⅰ期转录组数据分析
        4.4.5 病原感染下大眼幼体转录组数据分析
        4.4.6 病原感染下仔蟹Ⅰ期转录组数据分析
第5章 模式识别受体SpLGBP的分子基础研究
    5.1 实验材料
        5.1.1 实验动物和菌株
        5.1.2 主要试剂
        5.1.3 主要仪器
        5.1.4 主要溶液配制
    5.2 实验方法
        5.2.1 引物设计
        5.2.2 青蟹细菌或LPS感染试验
        5.2.3 青蟹组织的采集
        5.2.4 生物信息学分析
        5.2.5 总RNA的提取
        5.2.6 cDNA的合成
        5.2.7 SpLGBP构建载体所需的目的基因片段的获得
        5.2.8 SpLGBP蛋白的原核表达与纯化
        5.2.9 细菌凝集实验
        5.2.10 糖类结合实验
    5.3 实验结果
        5.3.1 序列扩增和分析
        5.3.2 氨基酸序列生物信息学分析及同源性分析
        5.3.3 自然状态下青蟹SpLGBP在不同组织器官中的表达情况
        5.3.4 SpLGBP转录本在早期发育阶段的表达情况
        5.3.5 LPS或解藻弧菌感染后SpLGBP转录本在溞状幼体Ⅰ期、大眼幼体和仔蟹Ⅰ期中的表达情况
        5.3.6 LPS或副溶血弧菌感染下,血淋巴细胞和肝胰腺中SpLGBP基因的表达情况
        5.3.7 SpLGBP重组质粒构建
        5.3.8 SpLGBP的诱导表达
        5.3.9 SpLGBP蛋白的分离纯化
        5.3.10 BCA法测定目的蛋白的浓度
        5.3.11 细菌凝集实验
        5.3.12 糖类结合实验
    5.4 讨论
参考文献
结语
在学期间参加的科研项目及成果
致谢



本文编号：3733798