马鹿（Cervus elaphus）鹿茸角顶端茸皮与软骨组织转录组研究

发布时间：2017-05-17 21:07

  本文关键词：马鹿（Cervus elaphus）鹿茸角顶端茸皮与软骨组织转录组研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：鹿茸角是唯一每年周期性表形态再生的哺乳动物附件器官,即远端附件去除后还会完整地再生出来。因此鹿茸为研究再生的分子机理提供了一个独有的动物模型。鹿茸角一个再生周期包括四个阶段：快速生长期,钙化期,茸皮(也称为鹿茸)脱落期,以及硬角脱落期。在快速生长期,鹿角由软骨和骨组成,渗透以血管和神经网络,外覆茸皮。快速纵向生长始于每个鹿茸角顶端增生区。在此增生区内,在鹿茸软骨膜(AP)内的祖细胞进行增殖和分化,向外形成包于外部的茸皮,向内形成排列于垂直小梁上的软骨前体细胞和软骨细胞。鹿茸角具独有的茸性上皮,上分布有稀疏的绒毛,被称为鹿茸(茸皮)。研究表明,茸皮并不是包裹于角柄外典型头皮在鹿茸角部分上简单的延伸。茸皮再生始于包裹角柄创面皮肤的伤口愈合过程。但是其特殊性在于,当创伤愈合上皮迁移穿过角柄骨膜(PP)远端点后,皮肤从头皮类型开始转换成茸皮类型。相较于角柄皮肤(典型的头皮),茸皮缺乏皮下疏松结缔组织层,但有更厚的表皮层,并能形成新的毛囊。这些新形成的毛囊缺乏立毛肌和汗腺,但具有较大皮脂腺。在增生区向内侧,虽然鹿茸软骨基质生物化学性质上类似于其他透明软骨,其独特之处在于具有血管网络。上述组织学特性使茸皮和软骨组织与其他组织显著不同,其中通过一系列的增殖、成型、分化事件,基因表达程序发生大规模的变化来形成新的结构。然而,我们对其转录组信息知之甚少。本论文对快速生长期马鹿(Cervus elaphus)茸皮和软骨进行了研究,通过自体转录组组装,并对构成55,095,730条干净短reads(测序序列)的总计长度为4,958,615,700核苷酸的序列进行了RNA-Seq分析。自体组装序列利用BLASTX与NCBI nr、GO、 COG、KEGG数据库进行比对和标注。结果表明：1. 利用Trinity软件自体组装共获得63,550条All-Unigenes。其中,两种组织共有的All-unigenes为33,295条,茸皮组织特有的All-unigenes为20,139条,软骨组织特有的All-unigenes为10,116条。2.通过nr注释,有33,471条All-Unigenes可以直接比对到Nr数据库,占All-unigenes总数比例为52.67%；32,762条All-Unigenes比对到Swissport数据库(51.55%)；25,577条All-Unigenes比对到KEGG数据库；11,428条All-Unigenes比对到COG数据库(17.98%)；此外,还有9,252条All-Unigenes比对到GO数据库(14.56%)。其余序列用ESTscan软件进行编码区预测,有691条可能为新的蛋白编码序列。3.功能分类及代谢通路分析结果表明,在茸皮和软骨的生长发育过程中,参与细胞、细胞骨架、核糖体结构、细胞外基质等构成、核酸与蛋白质生物合成转运、翻译、催化活性和代谢过程、细胞增殖调控、抗细胞凋亡等相关基因和通路起到了重要调控作用。4.从茸皮转录组数据中共挖掘得到44种生长因子及26种生长因子受体。其中IGF2表达量最高。利用qPCR法对8种随机选取的生长因子或受体进行基因表达水平的验证。结果表明qPCR法与转录组分析结果基本一致。5.茸皮和软骨各自特异性表达6961和2776条基因。在两种组织共同表达基因中,有7,966条基因表达差异显著(|log2Ratio|≥1且FDR≤0.001)。其中,茸皮较软骨有5,779条All-unigenes表达显著上调,而软骨较茸皮有2,187条基因表达显著上调。通过GO功能富集分析及KEGG通路富集分析,这些差异表达基因主要参与细胞结构、细胞代谢、蛋白质相互作用、催化活性等生物学进程。其中涉及注释了5,328个基因的236条通路。上述数据结果是目前关于马鹿鹿茸角顶端茸皮和软骨再生最全面的基因序列。将为进一步研究鹿茸分子遗传学和功能基因组学提供依据。
【关键词】：马鹿(Cervus elaphus) 鹿茸角 茸皮 软骨 再生 快速生长期 转录组
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S825
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 1 绪论12-38
• 1.1 测序技术引言12-13
• 1.2 Next Generation测序技术13-14
• 1.3 RNA-Seq测序14-27
• 1.3.1 样品分离和文库制备15-18
• 1.3.2 测序和成像18
• 1.3.3 从生物学到生物信息学的转换18-19
• 1.3.4 基因组映射和Read装配19-22
• 1.3.5 定量基因表达与异构体丰度22-26
• 1.3.6 差异表达26-27
• 1.4 NGS技术展望27
• 1.5 鹿茸角再生引言27-29
• 1.6 有尾类四肢再生概述29-30
• 1.7 鹿茸角再生基本概念及其与肢体再生比较30-33
• 1.8 鹿茸角再生是否涉及芽基形成?33-35
• 1.9 鹿茸角的表形态再生过程35-36
• 1.10 本论文研究的目的和意义36-38
• 2 马鹿鹿茸增生区茸皮和软骨转录组测序及数据库建立38-49
• 2.1 材料与方法38-39
• 2.1.1 马鹿鹿茸样品采集38
• 2.1.2 茸皮与软骨组织RNA提取与检测38
• 2.1.3 NGS测序38-39
• 2.1.4 数据处理与装配39
• 2.2 结果39-46
• 2.2.1 总RNA提取39
• 2.2.2 NGS测序产物产量39-40
• 2.2.3 Contig组装结果40-43
• 2.2.4 Unigene组装结果43-46
• 2.3 讨论46-48
• 2.4 本章小结48-49
• 3 马鹿鹿茸增生区茸皮和软骨转录组功能注释及代谢通路分析49-67
• 3.1 材料与方法49-50
• 3.1.1 All-Unigene表达量计算49
• 3.1.2 功能注释49-50
• 3.2 结果50-63
• 3.2.1 蛋白数据库比对结果50-51
• 3.2.2 COG功能分类51-55
• 3.2.4 CDS区的预测与分析55-56
• 3.2.5 KEGG通路分析56-61
• 3.2.6 茸皮中生长因子及其受体61-63
• 3.2.7 利用realtime-qPCR确认茸皮中生长因子及其受体表达63
• 3.3 讨论63-66
• 3.4 本章小结66-67
• 4 马鹿鹿茸增生区茸皮和软骨转录组差异表达基因分析67-81
• 4.1 材料与方法67
• 4.2 结果67-77
• 4.2.1 鹿茸角中高丰度表达基因67-68
• 4.2.2 鹿茸组织特异性表达基因68
• 4.2.3 GO功能富集分析68-72
• 4.2.4 KEGG Pathway富集分析72-77
• 4.3 讨论77-79
• 4.4 本章小结79-81
• 结论81-82
• 参考文献82-93
• 附录93-129
• 攻读学位期间发表的学术论文129-130
• 致谢130-131

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