民猪FST基因的克隆及其在冷诱导细胞凋亡过程中的功能初探

发布时间：2017-05-17 17:20

  本文关键词：民猪FST基因的克隆及其在冷诱导细胞凋亡过程中的功能初探，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：卵泡抑素(follistatin,FST)得名的原因是因为其对促卵泡素有很强的抑制作用,是一种单链糖蛋白,最初,对卵泡抑素的研究多集中在生殖系统中。近年来的研究表明,FST能与TGF-β超家族的多个成员相互作用,在细胞增殖、脂肪细胞和神经细胞分化、调节能量代谢等生殖系统以外的多个生物过程中发挥重要的调控作用。本课题组在利用基因芯片筛选民猪抗寒基因时,发现FST与民猪冷应激存在着相关性。本实验以FST基因为研究对象,对民猪FST基因及其侧翼序列进行克隆、测序,分析FST基因的核心启动子区及其甲基化情况,并在构建FST基因稳定过表达和干扰的猪成纤维细胞系的基础上,对其在冷诱导引起的细胞凋亡中发挥的作用进行了探索,通过数字基因表达谱(Digital gene expression,DGE)方法检测其发挥作用的通路,得到的结果如下:(1)成功以基因组为模板克隆测序方法得到民猪5’侧翼序列(1800 bp),与NCBI序列(GenBank No.NC_010458.3)相比相似度为99%,肝脏组织c DNA为模板克隆了民猪FST基因全长CDS序列(1035 bp),与NCBI序列(GenBank No.NC_010458.3)相比有5个碱基差异,并造成3个错义突变,巢式PCR克隆了民猪FST基因部分3’UTR序列,PITA预测发现一个hsa-miR-320c的结合位点。(2)采用双荧光素酶报告基因检测系统,在瞬时转染的PK15细胞内鉴定了猪FST基因的启动子活性区,发现位于ATG上游-298bp~-291bp处的MZF1转录因子结合区域是影响FST基因启动子活性的关键区域,该元件缺失会显著影响FST基因的启动子活性,而过表达MZF1转录因子可以显著促进FST基因的表达。(3)对不同生活纬度(温度)的四个地方猪种耳组织样中FST基因启动子核心区的甲基化情况进行了检测,发现在四个地方猪种中FST基因的CpG岛均处于极低程度的甲基化状态,相互之间无差异。对成纤维细胞冷诱导过程中该区域的甲基化情况进行了检测,发现冷诱导过程没有改变该区域的甲基化情况,同样处于极低程度的甲基化状态。(4)流式细胞仪检测了4℃处理2h、5h、16h、20h、24h和40h的猪胎儿成纤维细胞凋亡的变化并统计分析,发现在最初的2h内细胞没有呈现明显的凋亡,是凋亡过程的诱导期,2h-5h细胞出现了显著的凋亡,并且凋亡程度与冷诱导时间成正比,40h时,细胞几乎全部裂解死亡。(5)Real-time PCR和Western blot检测4℃冷诱导过程中FST基因的表达,发现此过程中FST基因的表达量不断上调,推测FST基因在抵抗细胞冷诱导产生的细胞凋亡过程中发挥重要作用。Real-time PCR检测了细胞凋亡密切相关的Bcl-2、Bcl-2l1和Bax基因的变化,发现各基因表达出现下调趋势,Bcl-2基因在4℃处理24h后出现极显著下调。(6)原代培养猪胎儿成纤维细胞,构建FST基因的pc DNA3.1(+)-FST真核表达载体和pSilencer-FR1的RNA干扰载体,转染并G418筛选,成功建立了FST基因稳定干扰和稳定过表达的猪胎儿成纤维细胞系。(7)MTT法检测FST基因对细胞增殖的影响,发现FST基因过表达能显著促进成纤维细胞的增殖,FST基因干扰后,与正常细胞相比增殖缓慢,但与阴性对照组相比,差异不显著。(8)4℃冷诱导5h,FST基因过表达组细胞凋亡程度较弱,而FST基因干扰组细胞出现局部变大、空泡等凋亡现象。Real-time PCR检测了FST基因对4℃冷诱导过程中Bcl-2、Bcl-2l1和Bax基因表达的影响,发现与对应时间点空白组和阴性对照组细胞相比,FST基因过表达能促进Bcl-2和Bcl-2l1基因表达上调和Bax基因表达下调,并且与FST基因干扰组细胞相比,FST基因过表达能明显上调Bcl-2/Bax基因表达的比例。(9)数字基因表达谱方法检测并分析FST基因稳定过表达和干扰的细胞系中的差异表达基因,并对其进行了GO分析和pathway显著性富集。发现两实验组中与凋亡相关的通路都指向了p53信号通路。推测FST基因参与p53信号通路的调节,在细胞冷诱导产生的凋亡中发挥作用。
【关键词】：卵泡抑素(follistatin FST) 启动子 甲基化 冷诱导 功能 通路
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S828
【目录】：

• 摘要10-12
• Abstract12-14
• 1 前言14-30
• 1.1 Follistatin及其基因的结构特征14
• 1.2 FST的生物学作用及其机制14-17
• 1.2.1 卵泡抑素-激活素调控系统14-15
• 1.2.2 卵泡抑素在动物生殖系统中的作用15
• 1.2.3 卵泡抑素在生殖系统以外的生物学作用15-17
• 1.2.4 FST的分泌调节17
• 1.3 DNA甲基化17-23
• 1.3.1 DNA甲基化的形式和机制存在差异17-18
• 1.3.2 DNA全新甲基化的引发18-19
• 1.3.3 DNA甲基化调控基因表达的两种假说19
• 1.3.4 DNA甲基化的功能19-21
• 1.3.5 影响DNA甲基化的因素21-22
• 1.3.6 DNA甲基化主要的研究方法22-23
• 1.4 冷诱导与细胞凋亡23-25
• 1.4.1 冷诱导细胞凋亡的主要机制23-25
• 1.4.2 细胞凋亡相关的基因25
• 1.5 RNA干扰技术25-26
• 1.5.1 RNA干扰技术的特点25-26
• 1.5.2 RNA干扰技术的应用26
• 1.6 测序技术的发展及应用26-28
• 1.6.1 第一代测序技术26
• 1.6.2 第二代测序技术26-27
• 1.6.3 第三代测序技术27
• 1.6.4 基因差异表达技术27
• 1.6.5 数字基因表达谱27-28
• 1.7 本研究的目的和意义28-30
• 2 实验材料与方法30-52
• 2.1 实验材料30-33
• 2.1.1 动物组织30
• 2.1.2 细胞株30
• 2.1.3 实验试剂及耗材30
• 2.1.4 实验仪器30-31
• 2.1.5 实验主要药品配制31-32
• 2.1.6 主要分子生物学软件32
• 2.1.7 相关生物信息学网站32-33
• 2.2 实验方法33-52
• 2.2.1 猪基因组DNA的提取33
• 2.2.2 民猪总RNA提取33-34
• 2.2.3 民猪FST基因启动子区、CDS区和 3’UTR克隆测序34-36
• 2.2.4 FST基因CDS区克隆测序36
• 2.2.5 FST基因 3’UTR区克隆测序36
• 2.2.6 猪FST基因核心启动子定位36-42
• 2.2.7 四种地方猪FST基因启动子核心区的甲基化状态的检测42-44
• 2.2.8 FST基因在猪胎儿成纤维细胞冷诱导过程中的作用初探44-46
• 2.2.9 FST基因稳定过表达和干扰成纤维细胞系的建立46-50
• 2.2.10 FST基因过表达和干扰对细胞的影响50
• 2.2.11 过表达和干扰细胞系的数字基因表达谱测序50-52
• 3 结果与分析52-91
• 3.1 民猪FST基因启动子区、CDS区和 3’UTR的克隆测序结果52-62
• 3.1.1 猪基因组DNA提取52
• 3.1.2 民猪总RNA提取52-53
• 3.1.3 民猪FST基因启动子区扩增结果53-55
• 3.1.4 民猪FST基因CDS区扩增结果55-56
• 3.1.5 民猪FST基因 3’UTR的扩增结果56-58
• 3.1.6 民猪FST基因核心启动子的定位58-62
• 3.2 四种地方猪FST基因启动子核心区的甲基化状态比较62-63
• 3.3 冷诱导对猪成纤维细胞的影响及FST基因的功能63-71
• 3.3.1 4℃冷诱导对猪成纤维细胞凋亡的影响63-69
• 3.3.2 4 ℃冷诱导FST基因甲基化变化情况69-70
• 3.3.3 冷诱导过程中相关基因的表达变化70-71
• 3.4 FST基因稳定过表达和干扰成纤维细胞系的建立71-74
• 3.4.1 重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-FST的构建71
• 3.4.2 稳定过表达FST基因的成纤维细胞的转染和筛选71-72
• 3.4.3 重组干扰质粒的构建72-73
• 3.4.5 稳定干扰FST基因的成纤维细胞的转染和筛选73-74
• 3.5 FST基因过表达和干扰对细胞的影响74-78
• 3.5.1 FST基因对猪成纤维细胞增殖的影响74
• 3.5.2 稳定过表达和干扰FST基因对成纤维细胞冷诱导的影响74-76
• 3.5.3 细胞形态观察76
• 3.5.4 各实验组凋亡相关基因的mRNA表达量76-78
• 3.5.5 FST基因对Bcl-2 和Bax比例关系的影响78
• 3.6 数字基因表达谱结果分析78-91
• 3.6.1 RNA的质量检测78-79
• 3.6.2 测序质量评估79-81
• 3.6.3 基因表达定量81-91
• 4 讨论91-95
• 4.1 民猪FST基因的基本信息91
• 4.2 民猪FST基因核心启动子的定位91
• 4.3 FST基因与细胞增殖91-92
• 4.4 冷诱导与DNA甲基化92
• 4.5 冷诱导与猪成纤维细胞凋亡92-93
• 4.6 冷诱导与相关基因表达的变化93
• 4.7 FST基因与成纤维细胞冷诱导93-94
• 4.8 FST基因发挥作用的通路94-95
• 5 结论95-96
• 致谢96-97
• 参考文献97-107
• 攻读博士学位期间发表的学术论文107

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