转录因子MpbR驱动的结核分枝杆菌脂质生物合成调控及病原-宿主相互作用研究

发布时间：2023-02-23 17:35

　　结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起人和动物结核病的一种重要胞内致病菌。它具有独特的囊膜结构,囊膜中的脂质组分对结核分枝杆菌识别及侵染宿主吞噬细胞、逃避宿主免疫系统杀伤、适应宿主内环境压力等诸多方面有重要影响。磷脂酰肌醇甘露糖(PIMs)及其衍生物作为囊膜脂质结构的重要组成成分能介导结核分枝杆菌与宿主的互作,调节宿主的免疫应答。但是,关于这些特殊脂质组分的生物合成调控通路及其对结核分枝杆菌在宿主内毒力的影响目前还知之甚少。本研究首先利用耻垢分枝杆菌作为模式菌株系统筛选和发现了一个分枝杆菌中保守的PIMs生物合成相关的转录调控因子Mpb R,在此基础上进一步解析了其调节结核分枝杆菌PIMs生物合成的通路,阐明了这种脂质代谢调控对结核分枝杆菌逃避宿主免疫抑制的影响。主要结果如下:(1)文库筛选发现了一个调控分枝杆菌菌落表面形态和生物被膜形成的转录因子Mpb R。利用TM4噬菌体侵染实验,成功构建了包含有约30,000个耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)转座子插入突变体的文库。通过观察突变体菌株的单菌落形态,分离获得了180个...

【文章页数】：161 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
Abstract
缩略语表
1 前言
    1.1 结核分枝杆菌的囊膜结构
    1.2 分枝杆菌囊膜中脂质的合成及运输
    1.3 分枝杆菌囊膜的细菌学功能
        1.3.1 影响细菌的生长及分裂
        1.3.2 影响细菌的通透性
        1.3.3 影响细菌生物被膜形成
        1.3.4 影响细菌的菌落形态
    1.4 分枝杆菌囊膜的免疫学功能
        1.4.1 影响分枝杆菌对宿主细胞的入侵
        1.4.2 影响吞噬体的成熟
        1.4.3 影响宿主的免疫应答
    1.5 磷脂酰肌醇甘露糖(PIMs)是分枝杆菌囊膜的重要组分
        1.5.1 PIMs的生物合成
        1.5.2 PIMs的运输及定位
        1.5.3 PIMs影响分枝杆菌生理机能
        1.5.4 PIMs影响分枝杆菌侵染宿主细胞
        1.5.5 PIMs影响吞噬体成熟
        1.5.6 PIMs激活宿主免疫应答
        1.5.7 PIMs抑制宿主免疫应答
        1.5.8 PIMs作为免疫佐剂
    1.6 分枝杆菌囊膜中脂质合成的转录调控
        1.6.1 脂肪酸的合成调控
        1.6.2 复杂脂质的合成调控
    1.7 本研究的目的、意义和思路
        1.7.1 本研究的目的和意义
        1.7.2 本研究的思路
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株
        2.1.2 质粒
        2.1.3 引物
        2.1.4 培养基
        2.1.5 抗生素
        2.1.6 其他试剂配方
        2.1.7 试剂与试剂盒
        2.1.8 仪器
    2.2 方法
        2.2.1 TM4噬菌体的扩增
        2.2.2 耻垢分枝杆菌转座子插入突变体文库的构建
        2.2.3 耻垢分枝杆菌菌落形态变化突变体筛选
        2.2.4 耻垢分枝杆菌突变体测序
        2.2.5 分枝杆菌重组菌株的构建
        2.2.6 耻垢分枝杆菌生长曲线的测定
        2.2.7 结核分枝杆菌生长曲线的测定
        2.2.8 耻垢分枝杆菌生物被膜的培养
        2.2.9 结晶紫染色实验定量检测耻垢分枝杆菌生物被膜
        2.2.10 结核分枝杆菌生物被膜的培养
        2.2.11 结晶紫染色实验定量检测结核分枝杆菌生物被膜
        2.2.12 结核分枝杆菌小鼠肺部存活的测定
        2.2.13 小鼠肺部病理切片实验
        2.2.14 结核分枝杆菌脂质组测序
        2.2.15 结核分枝杆菌转录组测序
        2.2.16 实时荧光定量PCR(q RT-PCR)实验
        2.2.17 蛋白质纯化
        2.2.18 EMSA
        2.2.19 竞争性EMSA
        2.2.20 DNase I足迹实验
        2.2.21 细菌单杂交实验(B1H)
        2.2.22 染色质免疫沉淀实验(ChIP)
        2.2.23 β-半乳糖苷酶活性实验
        2.2.24 制备骨髓源巨噬细胞(BMDM)
        2.2.25 BMDM细胞转录组实验
        2.2.26 细胞因子检测实验
        2.2.27 NO检测实验
        2.2.28 ROS检测实验
        2.2.29 细胞凋亡实验
        2.2.30 免疫印迹实验
        2.2.31 细菌侵染率实验
        2.2.32 细菌胞内存活实验
3 结果与分析
    3.1 MpbR促进分枝杆菌形成生物被膜并增强细菌毒力
        3.1.1 分枝杆菌突变体的筛选和鉴定
        3.1.2 MpbR调节耻垢分枝杆菌菌落形态
        3.1.3 MpbR促进耻垢分枝杆菌生物被膜的形成
        3.1.4 MpbR促进结核分枝杆菌生物被膜的形成
        3.1.5 MpbR增强结核分枝杆菌在小鼠内的存活能力
    3.2 MpbR抑制结核分枝杆菌细胞壁中PIMs的积累
        3.2.1 MpbR负调控Mra1696/97 的转录
        3.2.2 Mra1696/97抑制结核分枝杆菌生物被膜的形成
        3.2.3 MpbR抑制结核分枝杆菌细胞壁中PIMs的积累
        3.2.4 Mra1696/97 利于结核分枝杆菌细胞壁中PIMs的积累
    3.3 MpbR降低宿主的免疫应答
        3.3.1 MpbR降低巨噬细胞免疫基因的转录
        3.3.2 MpbR抑制巨噬细胞分泌细胞因子
        3.3.3 MpbR抑制巨噬细胞产生NO及 ROS
        3.3.4 MpbR抑制巨噬细胞凋亡
        3.3.5 MpbR促进结核分枝杆菌在巨噬细胞内的存活
4 总结与讨论
    4.1 总结
    4.2 讨论
        4.2.1 关于分枝杆菌脂质合成相关基因
        4.2.2 关于结核分枝杆菌囊膜中Ac1PIM2和Ac2PIM2 的代谢调控
        4.2.3 关于Ac1PIM2和Ac2PIM2 的运输调控通路
        4.2.4 关于Ac1/Ac2PIM2 代谢调控对细胞因子分泌的影响
        4.2.5 关于MpbR介导的调控对巨噬细胞ROS及 NO产生的影响
        4.2.6 关于MpbR介导的调控对巨噬细胞凋亡的影响
    4.3 展望
        4.3.1 关于MpbR感应宿主胞内环境压力的机制
        4.3.2 关于Mra1696/97 运输PIMs的机制
        4.3.3 关于MpbR调节分枝杆菌囊膜中PIMs积累的新机制
        4.3.4 关于MpbR调节宿主免疫的分子机制
        4.3.5 针对MpbR或 PIMs开发抗结核药物的可能性
参考文献
论文发表情况
致谢



本文编号：3748438