CsMLO1和CsMLO2在黄瓜抗棒孢叶斑病中的功能分析

发布时间：2023-04-10 04:28

　　黄瓜(Cucumis sativus)是我国设施栽培中主要的蔬菜作物之一。多主棒孢(Corynespora cassiicola)是重要的蔬菜传染性病原真菌,可引起黄瓜棒孢叶斑病,严重危害黄瓜的生产。目前关于黄瓜对棒孢叶斑病的抗性机制研究甚少。实验室前期通过差异蛋白质组学和转录组学分析发现,在棒孢叶斑病侵染早期,黄瓜两个白粉病抗性基因(Mildew Resistance Locus O,MLO)CsMLO1(Cucsa.207280)和CsMLO2(Cucsa.308270)的蛋白与基因表达水平均出现明显上调。本论文研究了CsMLO1和CsMLO2基因表达特性与黄瓜应答棒孢叶斑病菌侵染的关系,通过基因瞬时沉默和过量表达初步揭示CsMLO1和CsMLO2基因在黄瓜响应棒孢叶斑病菌侵染中的作用;同时,利用酵母双杂交、萤火虫荧光素酶(LCI)互补系统和双分子荧光互补(BiFC)系统等技术,筛选到与其CsMLO1和CsMLO2发生相互作用的蛋白,探讨了CsMLO1和CsMLO2在调控黄瓜抗棒孢叶斑中的作用机制。本研究将为揭示黄瓜与棒孢叶斑病菌之间相互作用的分子机制提供依据,并将有利于更深入、精...

【文章页数】：145 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 黄瓜棒孢叶斑病
        1.1.1 黄瓜棒孢叶斑病的发生及危害
        1.1.2 黄瓜棒孢叶斑病病症及特点
        1.1.3 黄瓜棒孢叶斑病菌的遗传多样性和生理分化
        1.1.4 黄瓜棒孢叶斑病的防治方法
        1.1.5 黄瓜棒孢叶斑病抗性遗传规律的研究
    1.2 植物抗病性研究
    1.3 植物MLO研究
        1.3.1 MLO基因家族
        1.3.2 植物 MLO 结构特征
        1.3.3 MLO基因定位及表达模式
        1.3.4 MLO基因功能
        1.3.5 mlo介导的抗性机制
    1.4 本研究的目的和意义
    1.5 技术路线
第二章 黄瓜CsMLO1和CsMLO2 基因的克隆、定位及表达分析
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株及载体
        2.1.3 试剂配制
        2.1.4 引物合成及测序
    2.2 方法
        2.2.1 DNA和 RNA的提取及c DNA合成
        2.2.2 CsMLO1和CsMLO2 启动子和基因全长克隆
        2.2.3 亚细胞定位载体构建
        2.2.4 烟草叶片瞬时表达和原生质体提取
        2.2.5 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)
        2.2.6 激光共聚焦扫描显微镜的观察
        2.2.7 目的基因的生物信息学分析
    2.3 结果与分析
        2.3.1 CsMLO1和CsMLO2 基因全长和启动子的获得和分析
        2.3.2 CsMLO1和CsMLO2 基因生物信息学分析
        2.3.3 CsMLO1和CsMLO2 的亚细胞定位分析
        2.3.4 CsMLO1和CsMLO2 基因表达特异性分析
        2.3.5 不同外源物质处理下黄瓜CsMLO1和CsMLO2 的基因表达分析
    2.4 讨论
    2.5 本章小结
第三章 CsMLO1和CsMLO2 在黄瓜抗棒孢叶斑病中的作用
    3.1 材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 菌株及载体
        3.1.3 试剂配制
        3.1.4 引物合成及测序
    3.2 方法
        3.2.1 棒孢叶斑病菌活化与侵染
        3.2.2 黄瓜病情指数调查
        3.2.3 RNA的提取及c DNA合成
        3.2.4 CsMLO1和CsMLO2 基因瞬时过表达载体构建
        3.2.5 CsMLO1和CsMLO2 基因沉默表达载体构建
        3.2.6 重组质粒转化黄瓜子叶
        3.2.7 瞬时转化黄瓜子叶后组织化学染色
        3.2.8 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)
    3.3 结果与分析
        3.3.1 棒孢叶斑病菌胁迫下CsMLO1和CsMLO2 的基因表达分析
        3.3.2 CsMLO1和CsMLO2 基因瞬时过表达载体获得
        3.3.3 CsMLO1和CsMLO2 基因沉默表达载体获得
        3.3.4 重组质粒转化根癌农杆菌检测
        3.3.5 CsMLO1和CsMLO2 基因瞬时过表黄瓜子叶鉴定
        3.3.6 CsMLO1和CsMLO2 基因瞬时沉默黄瓜子叶鉴定
        3.3.7 瞬时过表达CsMLO1和CsMLO2 基因黄瓜子叶的棒孢叶斑病抗性鉴定
        3.3.8 瞬时沉默CsMLO1和CsMLO2 基因黄瓜子叶的棒孢叶斑病抗性鉴定
        3.3.9 CsMLO1和CsMLO2 基因对病程相关基因的调控表达
    3.4 讨论
    3.5 本章小结
第四章 CsMLO1和CsMLO2 在黄瓜抗棒孢叶斑病中的作用机制
    4.1 材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 菌株及载体
        4.1.3 试剂配制
        4.1.4 引物合成及测序
    4.2 方法
        4.2.1 棒孢叶斑病菌活化与侵染
        4.2.2 黄瓜病情指数调查
        4.2.3 瞬时转化黄瓜子叶相关基因表达检测、抗性相关酶活及内源ABA含量测定
        4.2.4 酵母双杂交试验
        4.2.5 萤火虫荧光素酶互补(LCI)试验
        4.2.6 蛋白表达检测
        4.2.7 双分子荧光互补(BiFC)试验
        4.2.8 烟草叶片表皮细胞中CsMLO1和CsCaM3 共定位试验
        4.2.9 黄瓜子叶中共表达CsMLO1和CsCaM3 触发的防卫反应试验
    4.3 结果与分析
        4.3.1 CsMLO1和CsMLO2 基因参与调控的抗病信号途径
        4.3.2 CsMLO1和CsMLO2 通过钙调素信号介导黄瓜的防卫反应
    4.4 讨论
    4.5 本章小结
全文总结与展望
本论文的特色和创新之处
参考文献
附录
缩略词
致谢
攻读学位期间发表学术论文
申请专利



本文编号：3788327