柑橘绿霉病菌比较基因组及抗DMI杀菌剂机理研究

发布时间：2017-05-20 09:01

  本文关键词：柑橘绿霉病菌比较基因组及抗DMI杀菌剂机理研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：我国是世界上柑橘种植和消费的主要大国之一,柑橘年产量超过千万吨。柑橘绿霉病一直以来是困扰柑橘储藏、运输和销售环节的主要问题。在我国,每年因绿霉病导致的柑橘产量损失高达百万吨。目前对柑橘绿霉病的防治手段捉襟见肘,病菌抗药性产生的速率远超药剂更替的速率,对农业生产安全带造成了严重的威胁。然而,由于对病菌的侵染过程和杀菌剂作用机理缺乏足够的认识,如何有效提高病害的防治效果,同时减少对环境的伤害是我们目前所面临的重大挑战。本研究在此背景下,通过对柑橘绿霉病菌的全基因组测序,系统了解了病菌的遗传组成,同时在获得基因组信息的基础上,阐明了我国柑橘绿霉病菌抗DMI杀菌剂主要菌群的抗性调控机理。研究结果如下： 1.柑橘绿霉病菌基因组测序揭示大量次生代谢及细胞壁水解酶等基因家族的丢失 通过全基因组测序,我们获得了约26Mb的柑橘绿霉病菌基因组序列,包含103个scaffold。该基因组共编码约9,000个蛋白和162个tRNA。重复序列约占整个基因组的1%。通过与其他青霉菌、曲霉菌以及近缘的植物病原真菌比较分析后发现,柑橘绿霉病菌基因组更为紧凑,编码相对较少的基因。基因组共线性和蛋白家族进化分析显示,柑橘绿霉病菌有100多个家族发生了明显的缩减,仅有两个家族发生了扩增。通过对次生代谢物合成基因簇的预测,我们发现柑橘绿霉病菌中丢失了大部分毒素合成基因簇的关键合成基因,仅保留了一个完整的tryptoquialanine合成基因簇,这一结果解释了前人研究发现柑橘绿霉病菌毒素合成能力较弱的现象,同时也预示毒素跟病菌的致病能力并不相关。通过碳氢化合物代谢相关酶的比较发现,柑橘绿霉病菌丢失了大量的细胞壁水解酶,这也可能是导致该病菌寄主范围较窄的原因之一。 2.线粒体基因组比较分析显示柑橘绿霉病菌在进化过程了丢失了内含子 通过基因组测序数据的拼接和实验验证,我们得到了柑橘绿霉病菌的全长线粒体基因组,该线粒体基因组大小为28,978bp,平均A+T含量为74.7%,共编码15个蛋白,27个tRNA,以及两个核糖体大、小亚基RNA基因。与酵母等物种相比,青霉属真菌线粒体基因组虽然编码能力(编码基因数)大致相当,但其编码效率较高(80%为编码序列)。青霉菌和曲霉菌的线粒体基因组比较分析发现,这些菌中线粒体基因组的序列和编码基因的排列都比较保守,其中atp8基因可能受到负选择作用。此外,线粒体内含子在所比较的几个真菌中差异相对较大,而柑橘绿霉病菌在进化过程中可能丢失了一些内含子。 3.比较转录组揭示柑橘绿霉病菌在碳源利用及PacC调控基因方面的差异 通过对柑橘绿霉病菌在柑橘皮和葡萄糖培养基上的转录组分析,我们发现在柑橘皮培养基上有290个基因发生了上调表达,而123个基因发生了下调表达。使用GO数据库对差异表达基因进行功能注释后发现这些差异基因主要参与一些代谢过程。此外,很多参与碳源利用的基因都发生了上调,如木酮糖还原酶,翻转酶,几丁质酶,和β-N乙酰已糖胺酶等。相反,参与氨基酸、核苷酸代谢的这些基因大多都没有发生差异表达。另外,部分细胞壁水解酶以及tryptoquialanine的整个合成基因都发生了上调表达。 柑橘绿霉病菌和胶孢炭疽菌都能够侵染柑橘果实,然而两者采取截然不同的策略,前者在侵染的时候能够产生有机酸使环境酸化,而后者则分泌胺类物质使环境碱化。通过对这两个真菌中PacC突变体的表达谱分析后发现,产酸和产碱真菌中PacC的调控机理已经发生了较为明显的分化,尽管识别的模体和调控的基因家族相对保守,但是对于特定基因的调控方式(上调或下调)以及表达量差异明显,产碱真菌中尽管被抑制的基因和被激活的基因数目相当,但是碱性表达基因在PacC激活情况下表达量有很强的优势。而产酸真菌中,大量的基因在碱性条件下被抑制表达,但当病菌生长过程中,环境pH不断降低,这些基因将陆续被激活,从而参与生长和致病过程。 4. PdCYP51B基因的超量表达是造成柑橘绿霉病菌抗DMI杀菌剂的原因 在2000年到2010年期间,我们在浙江省主要柑橘产区收集了403个柑橘绿霉病菌菌株,其中,高达89%的抗性菌株其抗性机理不明。为此,我们比较了不同的抗性和敏感菌株,发现柑橘绿霉病菌中存在另外两个相似度较高的CYP51基因,称之为PdCYP51B和PdCYP51C。进一步分析发现在未知抗性菌株中,PdCYP51B启动子区都含有一段199bp序列的插入,这个特征在抑霉唑敏感菌株和已知抗性基因型的菌株中均不存在。将敏感菌株中的PdCYP51B基因转入柑橘绿霉病菌后,突变体的抗药性增加,而将含有199bp序列插入的PdCYP51B基因转入病菌后,突变体的抗药性增加更高。说明,199bp序列的插入造成了PdCYP51B基因的超量表达,从而赋予了病菌对药剂的抗性。 5.199bp插入片段是一个具有转座和启动子活性的微小转座子 对上述199bp插入片段进行序列分析,我们发现了一个TSD (target site duplication)和一个TIR (terminal invert repeat)位点。此外,该序列无编码能力,能够形成稳定的二级结构,且富含A+T。基于以上分析,我们认为该199bp属于微小转座子家族(miniature inverted-repeat transposable element, MITE),命名为PdMLEl。数据库搜索和Southern杂交显示,PdMLEl仅存在于柑橘绿霉病菌中,且拷贝数较多。GFP融合表达显示,PdMLEl能够启动GFP表达,且启动子能力较强。通过对PdMLEl核心启动子序列定位,我们得到了一段20bp的启动子核心区域,同时我们也通过类似的方法获得了PdCYP51B基因原始启动子的核心区域,综合以上信息,我们提出了一个转座子影响病菌抗药性的调控模型。 以上五部分内容的研究相辅相成,不仅揭示了柑橘绿霉病菌抗药性的产生和调控机理,同时更多的是揭示了柑橘绿霉病菌的基因组遗传信息,给后续深入理解病菌其他方面的分子机理提供了研究基础。
【关键词】：柑橘绿霉病菌 基因组测序 转录组测序 抗药性 植物病原真菌 转座子 调控模型
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S436.66
【目录】：

• 致谢7-11
• 摘要11-14
• Abstract14-18
• 第一章 绪论18-31
• 1.1 课题背景18-19
• 1.2 病原真菌侵染果实过程和互作机制19-24
• 1.2.1 病原真菌侵染和定殖的过程19-20
• 1.2.2 果皮对真菌侵染和定殖的影响20-21
• 1.2.3 果实防卫反应的影响21-22
• 1.2.4 有关果实病原真菌致病机制的研究22-24
• 1.3 柑橘绿霉病化学防治及病菌抗药性研究24-29
• 1.3.1 DMI杀菌剂的作用机理25
• 1.3.2 DMI杀菌剂抗性产生及其机理25-27
• 1.3.3 靶标基因上调表达机理27-28
• 1.3.4 柑橘绿霉病菌抗DMI杀菌剂新型分子机理28-29
• 1.4 高通量测序在揭示病菌致病机理中的应用29-30
• 1.5 本研究的目的和意义30-31
• 第二章 柑橘绿霉病菌基因组测序和比较基因组分析31-51
• 2.1 引言31
• 2.2 材料和方法31-34
• 2.2.1 菌株及培养条件31-32
• 2.2.2 DNA提取及基因组测序、组装32
• 2.2.3 基因预测及注释32-33
• 2.2.4 基因组共线性、直系同源基因和进化分析33
• 2.2.5 蛋白家族分类与进化分析33
• 2.2.6 分泌蛋白预测33-34
• 2.2.7 次级代谢物合成基因簇预测34
• 2.2.8 在线数据34
• 2.3 结果与讨论34-49
• 2.3.1 柑橘绿霉病菌形态及侵染循环34-35
• 2.3.2 柑橘绿霉病菌基因组特征35-37
• 2.3.3 青霉属直系同源基因比较37-40
• 2.3.4 柑橘绿霉病菌与其他真菌基因组共线性比较40-41
• 2.3.5 柑橘绿霉病菌致病相关基因41-43
• 2.3.6 柑橘绿霉病菌细胞壁水解酶43-46
• 2.3.7 柑橘绿霉病菌毒素合成46-47
• 2.3.8 柑橘绿霉病菌ABC转运蛋白47-49
• 2.4 本章小结49-51
• 第三章 柑橘绿霉病菌线粒体基因组51-59
• 3.1 引言51
• 3.2 材料与方法51-52
• 3.2.1 菌株、培养条件、基因组测序51-52
• 3.2.2 生物信息学分析52
• 3.3 结果与讨论52-57
• 3.3.1 线粒体基因特征52
• 3.3.2 线粒体蛋白编码基因52-55
• 3.3.3 线粒体内含子及内含子基因55-57
• 3.3.4 线粒体tRNA基因57
• 3.3.5 线粒体rRNA基因57
• 3.4 本章小结57-59
• 第四章 柑橘绿霉病菌比较转录组研究59-73
• 4.1 引言59-60
• 4.2 材料与方法60-61
• 4.2.1 菌株与培养条件60
• 4.2.2 文库制备和数据分析60-61
• 4.3 结果与讨论61-70
• 4.3.1 不同培养基上的转录组差异61-66
• 4.3.2 不同真菌之间PacC调控差异66-70
• 4.4 本章小结70-73
• 第五章 柑橘绿霉病菌抗DMI杀菌剂新基因型的发现73-92
• 5.1 引言73
• 5.2 材料与方法73-80
• 5.2.1 菌株、材料及培养方法73-74
• 5.2.2 培养基74-75
• 5.2.3 试剂75-76
• 5.2.4 引物序列76-77
• 5.2.5 抑霉唑抗性表型和基因型检测77
• 5.2.6 PdCYP51B和PdCYP51C基因的克隆和序列分析77
• 5.2.7 实时定量PCR77-78
• 5.2.8 过表达载体构建78
• 5.2.9 农杆菌介导的遗传转化78-79
• 5.2.10 Southern杂交79-80
• 5.2.11 PCR方法检测柑橘绿霉病菌抗性基因型80
• 5.3 结果与讨论80-89
• 5.3.1 柑橘绿霉病菌对抑霉唑抗性及抗性基因型80-81
• 5.3.2 CYP51同源基因的克隆81-82
• 5.3.3 PdCYP51B启动子区含有199bp序列插入82-84
• 5.3.4 199bp插入序列的生物信息学分析84
• 5.3.5 PdCYP51B基因在IMZ-R3菌株中超量表达84-85
• 5.3.6 PdCYP51同源基因均能被抑霉唑诱导85-86
• 5.3.7 过表达PdCYP51B基因降低病菌对抑霉唑的敏感性86-87
• 5.3.8 基于双重PCR的DMI抗性基因型检测87-89
• 5.4 本章小结89-92
• 第六章 柑橘绿霉病菌抗DMI杀菌剂新基因型的调控机理92-103
• 6.1 引言92-93
• 6.2 材料与方法93-94
• 6.2.1 菌株和培养方法93
• 6.2.2 载体构建93
• 6.2.3 启动子定位93-94
• 6.2.4 Southern杂交94
• 6.2.5 生物信息学分析94
• 6.3 结果与讨论94-101
• 6.3.1 199bp插入序列是一个转座子94-95
• 6.3.2 PdMLE1特异且广泛的存在于柑橘绿霉病菌中95-96
• 6.3.3 PdMLE1是一个强启动子96-97
• 6.3.4 PdMLE1和PdCYP51B核心启动子区定位97-99
• 6.3.5 PdMLE1的全基因组插入位点分析99-101
• 6.4 本章小结101-103
• 第七章 全文总结103-107
• 7.1 柑橘绿霉病菌基因组测序及比较基因组研究103-104
• 7.2 柑橘绿霉病菌抗药性研究104-105
• 7.3 全文创新点105-106
• 7.4 全文不足之处106
• 7.5 今后的研究方向106-107
• 参考文献107-119
• 附录119-127
• 研究生期间发表论文127-128

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 Guylaine Poisson;Cedric Chauve;Anne Bergeron;;FragAnchor: A Large-Scale Predictor of Glycosylphosphatidylinositol Anchors in Eukaryote Protein Sequences by Qualitative Scoring[J];Genomics Proteomics & Bioinformatics;2007年02期

2 李红叶 ,谢清云 ,宋爱环;抑霉唑敏感与抗性指状青霉菌株CYP51基因序列比较[J];菌物系统;2003年01期

3 姜丽英;陈国庆;施品忠;徐法三;李红叶;;嘧霉胺对采后柑橘绿霉病的防治效果[J];农药学学报;2010年02期

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5 ;Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of the phytopathogenic fungus Penicillium digitatum[J];Journal of Zhejiang University(Science B:An International Biomedicine & Biotechnology Journal);2008年10期

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本文编号：381130