免疫蛋白酶体在HP-PRRSV致病机制中的作用研究

发布时间：2023-08-26 06:11

　　猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)(俗称蓝耳病)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染引起的猪的一种急性、高度传染的病毒性传染病,主要引起以间质性肺炎和胸腺萎缩为特征的组织病理学变化。高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)感染猪后引发的严重免疫抑制,是其造成病理损伤的重要原因。然而,该免疫抑制的发生机制尚未阐明。据研究证实,HP-PRRSV非结构蛋白NSP1α与NSP4分别与参与抗原递呈途径重要的主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex,MHC)I 类分子的重链(SLA-IHC)和轻链(β2M)相互作用,引起细胞毒性T细胞(Cytotoxic T Lymphocytes,CTL)的活化受限,抑制细...

【文章页数】：156 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
第1章 绪论
    1.1 猪繁殖与呼吸综合征研究进展
        1.1.1 病原学
        1.1.2 PRRSV引起免疫抑制机理
    1.2 免疫蛋白酶体研究进展
        1.2.1 免疫蛋白酶体:结构、组装、调节和功能
        1.2.2 免疫蛋白酶体在疾病病理中的作用
        1.2.3 研究免疫蛋白酶体功能的策略
        1.2.4 研究免疫蛋白酶体的意义
    1.3 本研究的目的与意义
第2章 IFN-γ与LPS协同刺激后PAM细胞的转录组学分析研究
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验动物与细胞
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 常用试剂配制
        2.1.4 主要仪器
        2.1.5 主要耗材
        2.1.6 论文中所使用的引物
        2.1.7 统计学方法
    2.2 实验方法
        2.2.1 原代猪肺泡巨噬细胞的分离及培养
        2.2.2 高通量转录组测序
        2.2.3 细胞总RNA的提取
        2.2.4 cDNA的合成
        2.2.5 Real-Time PCR (RT-PCR)
    2.3 结果
        2.3.1 与MO型PAMs相比,IFN-γ与LPS刺激下PAMs的转录组分析
        2.3.2 与MO型PAMs相比,M1型PAMs内差异表达上调或下调基因的鉴定
        2.3.3 与M0型PAMs相比,M1型PAMs内参与限制病毒复制相关基因的表达水平
        2.3.4 与M0型PAMs相比,M1型PAMs内参与抗原水解和递呈相关基因的表达水平
    2.4 小结与讨论
第3章 免疫蛋白酶体亚基LMP2,LMP7和MECL-1的克隆及表达分析
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验动物、细胞与病毒
        3.1.2 菌株与质粒
        3.1.3 主要试剂
        3.1.4 常用试剂配制
        3.1.5 主要仪器
        3.1.6 主要耗材
        3.1.7 分子生物学分析软件
        3.1.8 论文中所使用的引物
    3.2 实验方法
        3.2.1 细胞培养
        3.2.2 原代猪肺泡巨噬细胞的分离及培养
        3.2.3 PCR扩增
        3.2.4 胶回收
        3.2.5 TA克隆与细菌转化试验
        3.2.6 阳性克隆的鉴定及测序
        3.2.7 重组质粒的构建
        3.2.8 重组质粒的提取
        3.2.9 瞬时转染
        3.2.10 BCA法测定蛋白浓度
        3.2.11 Western blotting
        3.2.12 IFA检测目的蛋白的表达及细胞定位
        3.2.13 序列分析
    3.3 结果
        3.3.1 猪LMP2、LMP7和MECL-1的染色体定位和序列分析
        3.3.2 猪LMP2、LMP7和MECL-1的亚细胞定位
        3.3.3 在猪AMs细胞系中,PolyI:C诱导免疫蛋白酶体的产生
    3.4 小结与讨论
第4章 免疫蛋白酶体亚基在正常与炎症条件下猪肺组织的表达及分布
    4.1 实验材料
        4.1.1 实验动物、细胞与病毒
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 常用试剂配制
        4.1.4 主要仪器
        4.1.5 主要耗材
        4.1.6 论文中所使用的引物
    4.2 实验方法
        4.2.1 细胞培养
        4.2.2 原代猪肺泡巨噬细胞的分离及培养
        4.2.3 PRRSV的增殖
        4.2.4 病毒滴度测定
        4.2.5 细胞总RNA的提取
        4.2.6 cDNA的合成
        4.2.7 Real-Time PCR (RT-PCR)
        4.2.8 BCA法测定蛋白浓度
        4.2.9 Western blotting
        4.2.10 IFA检测目的蛋白的表达及细胞定位
        4.2.11 组织病理切片相关实验
        4.2.12 统计学方法
    4.3 结果
        4.3.1 猪肺内免疫蛋白酶体的表达
        4.3.2 在原代AMs中,LMP2表达的验证
        4.3.3 在原代AM和传代AM细胞系中,IFN-γ诱导免疫蛋白酶体的表达情况
        4.3.4 PRRSV感染后肺内免疫蛋白酶体的表达情况
        4.3.5 在体外感染PRRSV后,原代AMs中免疫蛋白酶体的表达情况
    4.4 小结与讨论
第5章 HP-PRRSV抑制IFN-γ介导的免疫蛋白酶体的表达
    5.1 实验材料
        5.1.1 实验动物、细胞与病毒
        5.1.2 主要试剂
        5.1.3 常用试剂配制
        5.1.4 主要仪器
        5.1.5 主要耗材
        5.1.6 论文中所使用的引物
    5.2 实验方法
        5.2.1 原代猪肺泡巨噬细胞的分离及培养
        5.2.2 PRRSV的增殖
        5.2.3 病毒滴度测定
        5.2.4 细胞总RNA的提取
        5.2.5 cDNA的合成
        5.2.6 Real-Time PCR(RT-PCR)
        5.2.7 BCA法测定蛋白浓度
        5.2.8 Western blotting
        5.2.9 IFA检测目的蛋白的表达
        5.2.10 流式细胞术
        5.2.11 统计学方法
    5.3 结果
        5.3.1 在PAMs中,HP-PRRSV抑制IFN-γ介导的免疫蛋白的诱导表达
        5.3.2 在PAMs中,HP-PRRSV以剂量依赖的方式抑制IFN-γ介导的免疫蛋白的诱导表达
        5.3.3 在RNA水平上,HP-PRRSV抑制IFN-γ介导的免疫蛋白酶体的诱导表达
        5.3.4 HP-PRRSV调控IFN-γ介导免疫蛋白诱导表达的分子机制初探
    5.4 小结与讨论
全文结论
参考文献
附录
致谢
作者简介



本文编号：3844105