Wnt/PLC/Ca 2+ 通路对猪卵泡颗粒细胞和卵母细胞凋亡及颗粒细胞激素分泌的影响机制

发布时间：2023-11-27 17:28

　　哺乳动物超过99%的卵子在发育过程中都会经历闭锁性退化而不排卵,在促性腺激素的作用下,其中一些可以达到排卵前阶段,为了促进濒危物种以及基因优良畜禽体外培养卵子更好的应用,卵子发生和卵泡发育的机制尚需进一步研究。颗粒细胞分泌的激素和生长因子对卵泡发育起重要作用,同时卵母细胞分泌各种生长因子也可以调节颗粒细胞的增殖和分化。在卵泡液中含有多种不同水平的类固醇激素,比如雌激素、孕酮和雄激素,可以通过作用于颗粒细胞生长以及卵泡液的形成来影响卵巢的卵泡发育。近年来很多的研究表明,Wnt信号可以调节小鼠和人类的性腺发育和性别分化,并且可以调节激素的合成和分泌,对哺乳动物卵泡形成和发育以及卵巢功能的维持具有重要作用,可以参与调控卵泡闭锁等生理过程。Wnt5a和Wnt11属于非经典Wnt蛋白,它们在颗粒细胞中表达并且在整个卵泡发育过程中发挥特异的调控作用。当颗粒细胞Wnt5a失去活性的时候可以导致小鼠卵泡闭锁增加和排卵率降低。然而Wnt非典型通路对猪卵泡发育的作用尚未见系统报道,本文探究Wnt/PLC/Ca²⁺通路对猪卵泡发育过程中凋亡和激素分泌的影响。本试验通过抽吸法取得直径为2...

【文章页数】：143 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要符号对照表
第一章 文献综述
    1.1 颗粒细胞和卵母细胞在哺乳动物卵泡闭锁和激素分泌中的作用
        1.1.1 哺乳动物卵巢的基本结构和功能
        1.1.2 卵泡发育的基本过程
        1.1.3 卵泡发育的调控途径
        1.1.4 颗粒细胞在卵泡发育中的作用
        1.1.5 卵母细胞的发育以及在卵泡发育中的作用
        1.1.6 颗粒细胞与卵母细胞的互作
    1.2 Wnt-Ca²⁺信号通路对卵泡发育的影响
        1.2.1 Wnt通路概述以及Wnt-Ca²⁺通路的组成
        1.2.2 Wnt-Ca²⁺通路在哺乳动物生理病理活动中的调节作用
        1.2.3 Wnt-Ca²⁺与Wnt典型通路的互作
        1.2.4 Wnt-Ca²⁺与其它信号通路的关系
    1.3 研究目的和意义
第二章 Wnt/PLC/Ca²⁺信号变化对猪颗粒细胞活力和卵母细胞成熟的调控
    2.1 前言
    2.2 试验材料
        2.2.1 主要试剂
        2.2.2 主要试验仪器
        2.2.3 试验动物来源
    2.3 试验方法
        2.3.1 猪卵巢的采集
        2.3.2 猪颗粒细胞和卵母细胞的培养
        2.3.3 猪颗粒细胞的鉴定
        2.3.4 CCK8法测定颗粒细胞活力
        2.3.5 卵母细胞成熟的判定
        2.3.6 孤雌激活和早期胚胎培养
        2.3.7 早期胚胎发育的评定
        2.3.8 统计学数据分析
    2.4 结果与分析
        2.4.1 猪颗粒细胞的鉴定
        2.4.2 不同浓度IWP-2对猪颗粒细胞活力的影响
        2.4.3 不同浓度抑制剂U73122对颗粒细胞活力的影响
        2.4.4 不同浓度激活剂m-3M3FBS对颗粒细胞活力的影响
        2.4.5 不同浓度IWP-2对猪卵母细胞第一极体排出率的影响
        2.4.6 不同浓度抑制剂U73122 或激活剂m-3M3FBS对卵母细胞成熟的影响.
    2.5 讨论
    2.6 小结
第三章 IWP-2对Wnt/PLC/Ca²⁺通路的抑制、对凋亡的促进及其对颗粒细胞激素的调控
    3.1 前言
    3.2 试验材料
        3.2.1 主要试剂
        3.2.2 主要试验仪器
    3.3 试验方法
        3.3.1 猪卵巢的采集以及猪颗粒细胞和卵母细胞的培养
        3.3.2 猪颗粒细胞和卵母细胞钙离子浓度的测定
        3.3.3 猪颗粒细胞RNA提取和反转录
        3.3.4 实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因和激素调控基因的表达水平
        3.3.5 Western Blot法检测凋亡相关蛋白和PLC四种亚基蛋白表达水平
        3.3.6 统计学数据分析
    3.4 结果与分析
        3.4.1 IWP-2对猪颗粒细胞和卵母细胞中Ca²⁺浓度的影响
        3.4.2 IWP-2对猪颗粒细胞和卵母细胞凋亡的影响
        3.4.3 IWP-2对颗粒细胞雌二醇和孕酮调控基因的影响
        3.4.4 IWP-2 对猪颗粒细胞和卵母细胞PLC四种亚基基因和蛋白表达的影响.
    3.5 讨论
    3.6 小结
第四章 PLC蛋白对猪卵泡发育过程中细胞凋亡、激素分泌和Wnt/Ca²⁺信号通路的影响
    4.1 前言
    4.2 试验材料
        4.2.1 主要试剂
        4.2.2 主要试验仪器
    4.3 试验方法
        4.3.1 猪卵巢的采集以及颗粒细胞和卵母细胞的培养
        4.3.2 颗粒细胞和卵母细胞的总RNA提取和反转录
        4.3.3 实时荧光定量PCR检测凋亡、激素和Wnt/Ca²⁺通路若干基因的表达
        4.3.4 Western Blot法检测凋亡和Wnt/Ca²⁺通路相关蛋白的表达
        4.3.5 Annexin V-FITC法检测猪颗粒细胞凋亡
        4.3.6 酶联免疫法(ELISA法)测定猪雌二醇和孕酮的含量
        4.3.7 猪颗粒细胞和卵母细胞钙离子浓度测定
        4.3.8 统计学数据分析
    4.4 结果与分析
        4.4.1 PLC蛋白对猪颗粒细胞和卵母细胞凋亡的调控
        4.4.2 PLC蛋白对猪颗粒细胞雌二醇和孕酮分泌的调控
        4.4.3 PLC蛋白对猪颗粒细胞和卵母细胞Wnt/Ca²⁺信号中PLC四个亚基、Ca²⁺浓度、三个钙离子敏感蛋白和若干下游基因的调控
    4.5 讨论
    4.6 小结
第五章 IWP-2与U73122或m-3M3FBS互作对猪卵泡Ca²⁺的调节以及对颗粒细胞凋亡和激素的调节作用
    5.1 前言
    5.2 试验材料
        5.2.1 主要试剂
        5.2.2 主要试验仪器
    5.3 试验方法
        5.3.1 猪卵巢的采集以及颗粒细胞和卵母细胞的培养
        5.3.2 猪颗粒细胞和卵母细胞钙离子浓度检测
        5.3.3 颗粒细胞总RNA提取和反转录
        5.3.4 实时荧光定量PCR检测颗粒细胞凋亡和激素调控基因相对表达
        5.3.5 统计学数据分析
    5.4 结果与分析
        5.4.1 IWP-2与U73122或m-3M3FBS相互作用对猪颗粒细胞和卵母细胞Ca²⁺浓度的影响
        5.4.2 IWP-2与U73122或m-3M3FBS相互作用对颗粒细胞凋亡调控基因的影响
        5.4.3 IWP-2与U73122或m-3M3FBS相互作用对颗粒细胞激素调控基因的影响
    5.5 讨论
    5.6 小结
第六章 Enzastaurin或 Enzastaurin与 U73122 互作对猪颗粒细胞激素和凋亡的调节作用
    6.1 前言
    6.2 试验材料
        6.2.1 主要试剂
        6.2.2 主要试验仪器
    6.3 试验方法
        6.3.1 猪卵巢的采集以及颗粒细胞的培养
        6.3.2 猪颗粒细胞总RNA提取和反转录
        6.3.3 实时荧光定量PCR检测猪颗粒细胞凋亡和激素调控基因相对表达
        6.3.4 Western Blot法检测猪颗粒细胞PKC蛋白表达的影响
    6.4 结果与分析
        6.4.1 Enzastaurin对猪颗粒细胞活力的影响
        6.4.2 Enzastaurin以及Enzastaurin与 U73122 互作对猪颗粒细胞凋亡相关基因和蛋白表达的影响
        6.4.3 Enzastaurin以及Enzastaurin与 U73122 互作对猪颗粒细胞雌二醇和孕酮激素相关基因表达的影响
        6.4.4 Enzastaurin以及Enzastaurin与 U73122 互作对PKCβ蛋白表达的影响
    6.5 讨论
    6.6 小结
第七章 结论与创新点
    7.1 结论
    7.2 创新点
下一步研究工作
附录
参考文献
致谢
个人简历



本文编号：3868247