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苹果内参基因的筛选及三种潜隐性病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

发布时间：2017-05-25 06:08

  本文关键词：苹果内参基因的筛选及三种潜隐性病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立，，由笔耕文化传播整理发布。


【摘要】：病毒病严重影响苹果的生长、产量以及果品质量,尚无有效防治药剂,树体一旦侵染很难根除,繁育无病毒苗木实行无毒化栽培是其防治的最有效途径。高效、灵敏、稳定的病毒检测技术是实现苹果无毒化栽培的重要技术保障之一。本研究在筛选出适用于苹果的内参基因的基础上,分别建立了苹果Actin基因及苹果茎沟病毒、茎痘病毒、褪绿叶斑病毒三种苹果潜隐性病毒的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法,旨在为进一步研究三种潜隐性病毒的侵染、增殖、分布以及时序变化等规律提供有效的技术手段,并为苹果病毒的多重实时荧光定量RT-PCR检测体系的研发奠定基础。主要研究结果如下:1、本研究采用SYB GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR技术,对Actin、TUB、GAPDH、18SrRNA、UBQ、nad5六个持家基因在苹果幼叶、成龄叶、枝皮、根皮和种子中的表达量进行了检测。经GeNorm软件分析发现,6个内参基因在五种不同组织器官中的表达稳定性由高到低排列顺序为:Actin=UBQ㧐GAPDH㧐nad5㧐TUB㧐18SrRNA,Actin和UBQ为优选内参基因。2、首次建立了苹果Actin基因的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据已公布的Actin基因序列设计了特异性引物和TaqMan探针,以体外转录的RNA为标准品绘制标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行检验。结果显示建立的标准曲线相关系数达0.999,扩增效率为106.5%;该方法的引物和探针特异性强;检测灵敏度为1.48×10 copies·μL-1的cRNA,比常规RT-PCR高1000倍;重复性好,组内和组间重复变异系数均小于2.65%。3、建立了苹果茎沟病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)外壳蛋白基因(coat protein,cp)保守序列设计了特异性引物和TaqMan探针,以构建的ASGV-cp重组质粒为标准品绘制标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行检验。建立的标准曲线相关系数达0.999,扩增效率为96.8%;该方法特异性好,与苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)、苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)、苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)均无交叉反应;灵敏度为10copies·μL-1,比常规RT-PCR高1000倍;组内和组间重复变异系数均小于1%。表明该方法具有特异性强、灵敏高、重复性好的优点,适用于实际样品中ASGV的快速准确检测。4、建立了苹果褪绿叶斑病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法。根据ACLSV cp基因的保守序列设计了特异性引物和TaqMan探针,以构建的ACLSV-cp重组质粒为标准品绘制标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行检验。结果显示,以ACLSV-cp重组质粒为标准品建立的标准曲线相关系数达0.999,扩增效率为103.7%;建立的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法特异性好,与ASGV、ASPV和ASSVd均无交叉反应;灵敏度为100 copies·μL-1,比常规RT-PCR高100倍;组内和组间重复变异系数均小于0.84%。表明TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法具有特异性强、灵敏高、重复性好的优点,适用于实际样品中ACLSV的快速准确检测。5、建立了苹果茎痘病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法。根据ASPV cp基因的保守序列设计了特异性引物和TaqMan探针,以体外转录的RNA为标准品绘制标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行检验。建立的标准曲线相关系数达0.996,扩增效率为99%;该方法特异性好,与ASGV、ACLSV及ASSVd均无交叉反应;其最低检测限为1.31×102 copies·μL-1,灵敏度比常规RT-PCR高100倍;组内和组间重复变异系数均小于1.85%。该方法具有特异性强、灵敏高、重复性好的优点,适用于实际样品中ASPV的快速定量检测。
【关键词】：苹果 内参基因 苹果茎沟病毒 苹果褪绿叶斑病毒 苹果茎痘病毒 TaqMan探针 实时荧光定量RT-PCR
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S661.1
【目录】：
  • 摘要4-6
  • Abstract6-14
  • 第一章 引言14-26
  • 1 实时荧光定量PCR技术概述14-18
  • 1.1 实时荧光定量PCR基本原理14-15
  • 1.2 实时荧光定量PCR检测方法15-16
  • 1.2.1 荧光嵌合法（SYBR GreenⅠ）15
  • 1.2.2 TaqMan探针法15-16
  • 1.2.3 分子信标法（Molecular beacons）16
  • 1.3 实时荧光定量PCR技术的定量方法16-17
  • 1.3.1 绝对定量法16-17
  • 1.3.2 相对定量法17
  • 1.4 实时荧光定量PCR在植物植物病理学研究中的应用17-18
  • 2 内参基因概述18-19
  • 2.1 常用的内参基因18
  • 2.2 内参基因的选择18-19
  • 3 苹果病毒病概述19-24
  • 3.1 苹果病毒病概况19-20
  • 3.2 苹果病毒的传播途径20
  • 3.3 苹果病毒病的防控措施20-21
  • 3.4 苹果潜隐性病毒的检测方法21-23
  • 3.4.1 指示植物法21
  • 3.4.2 电子显微镜技术21-22
  • 3.4.3 血清学方法22
  • 3.4.3 分子生物学技术22-23
  • 3.5 三种苹果潜隐性病毒23-24
  • 3.5.1 苹果茎沟病毒23-24
  • 3.5.2 苹果茎痘病毒24
  • 3.5.3 苹果褪绿叶斑病毒24
  • 4 本研究的目的意义24-26
  • 第二章 苹果六个内参基因的优选26-43
  • 1 材料与方法26-31
  • 1.1 试验材料26
  • 1.2 主要仪器及试剂26
  • 1.2.1 主要仪器26
  • 1.2.2 主要试剂26
  • 1.3 试验方法26-31
  • 1.3.1 总RNA的提取26-27
  • 1.3.2 总RNA完整性和纯度的检测27
  • 1.3.3 总RNA的纯化27-28
  • 1.3.4 cDNA的合成28
  • 1.3.5 引物的设计与合成28-29
  • 1.3.6 六个内参基因的常规PCR扩增及其引物退火温度筛选29-30
  • 1.3.7 六个内参基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR反应30
  • 1.3.8 数据分析30-31
  • 2 结果与分析31-41
  • 2.1 总RNA的提取31
  • 2.2 总RNA的纯化及cDNA合成31-32
  • 2.3 六个内参基因的常规PCR扩增及其引物退火温度的筛选32-35
  • 2.4 六个内参基因的实时荧光定量PCR反应35-40
  • 2.5 六个内参基因的筛选40-41
  • 2.5.1 六个内参基因的表达水平分析40
  • 2.5.2 六个内参基因的稳定性分析40-41
  • 3 讨论41-43
  • 第三章 苹果Actin基因TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立43-57
  • 1 材料与方法43-50
  • 1.1 试验材料43
  • 1.2 主要试剂及仪器43
  • 1.3 总RNA的提取43
  • 1.4 cDNA的合成43
  • 1.5 引物与探针的设计与合成43-44
  • 1.6 阳性重组质粒的构建44-47
  • 1.6.1 Actin基因的常规PCR扩增44
  • 1.6.2 目标片段的回收44-45
  • 1.6.3 目标片段的克隆45
  • 1.6.4 重组质粒的提取45-46
  • 1.6.5 重组质粒的鉴定46-47
  • 1.7 cRNA标准品的制备47-48
  • 1.7.1 阳性重组质粒的线性化处理47
  • 1.7.2 cRNA的体外转录及纯化47-48
  • 1.8 Actin基因TaqMan探针实时荧光定量PCR反应体系的建立48-50
  • 1.8.1 标准曲线的制作48-49
  • 1.8.2 反应体系与常规RT-PCR灵敏度的对比49
  • 1.8.3 反应体系的特异性49
  • 1.8.4 反应体系的重复性49-50
  • 2 结果与分析50-56
  • 2.1 Actin基因的常规PCR扩增及其产物的回收50-51
  • 2.2 阳性重组质粒的构建及鉴定51-53
  • 2.3 cRNA的体外转录53
  • 2.4 实时荧光定量RT- PCR标准曲线的制作53
  • 2.5 实时荧光定量PCR与常规PCR灵敏度的对比53-55
  • 2.6 实时荧光定量PCR的重复性55
  • 2.7 实时荧光定量PCR的特异性55-56
  • 3 讨论56-57
  • 第四章 苹果茎沟病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用57-66
  • 1 材料与方法57-59
  • 1.1 材料57
  • 1.2 主要试剂和仪器：57
  • 1.3 引物和探针的设计合成57-58
  • 1.4 总RNA的提取及cDNA的合成58
  • 1.5 阳性质粒标准品的构建58
  • 1.6 标准曲线的绘制58-59
  • 1.7 实时荧光定量RT-PCR反应体系的方法学测试59
  • 1.7.1 实时荧光定量RT-PCR的特异性试验59
  • 1.7.2 实时荧光定量RT-PCR的灵敏性试验59
  • 1.7.3 实时荧光定量RT-PCR的重复性试验59
  • 1.8 实际样品的检测59
  • 2 结果与分析59-65
  • 2.1 阳性质粒标准品的构建59-60
  • 2.2 标准曲线的建立60-61
  • 2.3 实时荧光定量RT-PCR特异性61
  • 2.4 实时荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR灵敏度的比较61-62
  • 2.5 实时荧光定量RT-PCR重复性62-63
  • 2.6 实际样品检测63-65
  • 3 讨论65-66
  • 第五章 苹果褪绿叶斑病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用66-72
  • 1 材料与方法66-68
  • 1.1 材料66
  • 1.2 方法66-68
  • 1.2.1 引物及探针的设计与合成66-67
  • 1.2.2 总RNA的提取及cDNA的合成67
  • 1.2.3 重组质粒标准品的制备及标准曲线绘制67
  • 1.2.4 实时荧光定量RT-PCR特异性、灵敏性、重复性试验67-68
  • 1.2.5 实际样品检测68
  • 2 结果与分析68-71
  • 2.1 重组质粒标准品的鉴定及标准曲线的绘制68
  • 2.2 实时荧光定量RT-PCR的特异性68-69
  • 2.3 实时荧光定量RT-PCR的灵敏度69-70
  • 2.4 实时荧光定量RT- PCR的重复性70
  • 2.5 实际样品检测结果70-71
  • 3 讨论71-72
  • 第六章 苹果茎痘病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用72-80
  • 1 材料与方法72-74
  • 1.1 材料72
  • 1.2 引物及探针的设计与合成72-73
  • 1.3 总RNA的提取及RT-PCR73
  • 1.4 阳性质粒的构建73
  • 1.5 标准品cRNA的制备及标准曲线的绘制73-74
  • 1.6 实时荧光定量RT-PCR反应体系的验证与实际样品检测74
  • 2 结果与分析74-79
  • 2.1 阳性质粒的构建74-75
  • 2.2 标准曲线的绘制75
  • 2.3 实时荧光定量RT-PCR的特异性75-76
  • 2.4 实时荧光定量RT-PCR的灵敏度76-77
  • 2.5 实时荧光定量RT-PCR的重复性77
  • 2.6 实际样品的检测结果77-79
  • 3 讨论79-80
  • 结论80-81
  • 参考文献81-90
  • 在读期间发表的论文90-91
  • 作者简历91-92
  • 致谢92-93

【参考文献】

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1 陶珍珍;李中安;贾敏;唐萌;唐科志;周常勇;周彦;;T3基因型柑橘衰退病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立及应用[J];园艺学报;2015年01期

2 吴然;李君英;邵建柱;孙建设;张鹤;;苹果锈果类病毒实时荧光PCR检测方法的建立[J];果树学报;2015年01期

3 黄妍妍;陈小飞;朱天生;;库尔勒香梨上苹果茎沟病毒的三种分子生物学检测技术比较研究[J];塔里木大学学报;2014年03期

4 胡加谊;罗志文;范鸿雁;李向宏;刘志昕;何凡;;菠萝凋萎相关病毒 2实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J];园艺学报;2014年06期

5 袁慕云;张旺;卓锦雪;谢力;陈碧玲;许龙岩;;基于TaqMan探针三重荧光PCR检测MRSA[J];中国卫生检验杂志;2014年02期

6 赵晓丽;周琦;孙宁;邓丛良;;啤酒花矮化类病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用[J];植物保护学报;2013年04期

7 姬盼;王连春;孔宝华;李晓鹏;曹克强;马钧;;侵染云南苹果的苹果褪绿叶斑病毒的RT-PCR检测和序列分析[J];云南农业大学学报(自然科学);2013年04期

8 乔雪华;郭超;邵建柱;孙建设;陈红霞;;八棱海棠种子潜带病毒检测及理化处理对其带毒状况的影响[J];果树学报;2013年03期

9 钱微;刘燕;肖琛闻;韦强;季权安;鲍国连;姚火春;;兔支气管败血波氏杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用[J];农业生物技术学报;2013年04期

10 郭立新;段维军;张祥林;邓丛良;闻伟刚;李世访;;啤酒花潜隐类病毒的实时荧光RT-PCR检测[J];植物病理学报;2012年05期

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1 于淼;海带（Saccharina japonica）内参基因筛选及部分管家基因的系统进化分析[D];中国海洋大学;2013年

2 张芳明;甜樱桃内参基因的筛选[D];河南农业大学;2013年

3 陈红霞;我国苹果主产区潜隐性病毒侵染特征研究[D];河北农业大学;2012年

4 李玲;苹果潜隐性病毒脱除及RT-PCR技术研究[D];河北农业大学;2008年


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