家蚕后部丝腺基因表达差异的分析与蚕丝性能改良的研究

发布时间：2017-05-25 07:01

  本文关键词：家蚕后部丝腺基因表达差异的分析与蚕丝性能改良的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：家蚕是鳞翅目泌丝型经济昆虫,丝腺是合成分泌丝蛋白、决定蚕丝产量和质量的重要组织器官。丝腺具有高效合成丝蛋白的能力,但采用家蚕丝腺生物反应器表达外源蛋白时,至今为止的所有实验结果都证明外源蛋白的表达量很低,极大多数仅占茧丝蛋白含量的百分之几。为了利用具有极强机械性能的黑寡妇蜘蛛牵引丝改良家蚕丝纤维的机械性能,本研究采用蛋白质组学技术和转录组学技术研究了家蚕后部丝腺基因表达调控的特征,初步揭示了丝腺高效合成丝蛋白的分子机制,提供了利用丝腺高效表达蜘蛛丝蛋白的方法和策略；本研究采用转基因技术创建了含有蜘蛛丝蛋白的家蚕品种,极大地改良了蚕丝的机械性能。具体取得的研究结果如下：1.转录组学分析揭示了影响蚕丝蛋白合成的代谢通路以秋丰、裸蛹(Nd)和丝胶茧(Nd-s)3个家蚕品种5龄第3天后部丝腺为材料,采用RNA-seq高通量测序的转录组研究方法,结果表明Nd和Nd-s这2个低丝量的突变品种中,组成茧丝蛋白基因的表达水平下降,导致丝产量降低；与丝腺生长发育相关的基因表达下调,阻碍了丝腺的发育,影响了丝蛋白的正常合成；丝腺组织中合成了大量不成熟的、错误折叠的蛋白,造成蛋白质量控制系统和抗氧化代谢等一系列耗能的代谢增加,大量的能量被空耗在用来维持细胞自身的稳态上面,最终影响了丝蛋白的合成代谢。2.蛋白质组学分析揭示了影响蚕丝蛋白合成的代谢通路采用转录组学分析相同的实验材料,用同位素标记定量法(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)蛋白质组学技术进行分析得知,Nd和Nd-s这2个低丝量的突变品种的茧丝关键蛋白表达量下降,丝腺发育相关的蛋白表达下调,丝蛋白合成及信号通路相关的蛋白表达下调,丝蛋白的分泌及运输途径相关的蛋白也受到影响,大量的能量被空耗到无效的代谢途径上,最终影响了丝蛋白的高效合成。3.采用转基因技术改良了家蚕茧丝的机械性能以piggyBac载体为基础,根据黑寡妇蜘蛛牵引丝蛋白设计并成功构建了包含不同重复单元的类MaSp1和MaSp2的系列载体,利用显微注射的方法,将其整合到家蚕的基因组内,经Inverse-PCR、Q-PCR、Western blotting等方法的检测,证明已成功获得了16个转蜘蛛丝基因家蚕品系。这些品系的茧丝的机械性能显著提高,与野生型对照品种相比,最大应力最高提高71.92%,最大应变提高34.508%,杨氏模量提高57.819%,韧性最高提高131.673%。4.证明了黑寡妇蜘蛛牵引丝的机械性能与其蛋白分子量大小成极显著的线性关系采用转基因技术获得了类黑寡妇蜘蛛Black Widow Spider, Latrodectus hesperus牵引丝MaSpl基因不同长度的分子的转基因蜘蛛丝家蚕,根据多个转基因家系以及杂合型和纯化型2种基因型对比研究结果,都证明了分子越长丝的机械性能越好,说明黑寡妇蜘蛛牵引丝的超级性能来源于她的分子长度,暗示了自然界机械性能优良的蛋白性丝纤维都采用高度重复的大分子蛋白的策略是生物进化的一种必然结果。综上所述,本研究通过对秋丰、裸蛹(Nd)和丝胶茧(Nd-s)3个家蚕品种的转录组和蛋白质组差异表达谱分析,揭示了丝蛋白高效合成的机制,为改良家蚕丝腺特性,作为生物反应器高效地合成外源蛋白奠定了分子基础。本研究采用转基因技术构建了转蜘蛛丝基因家蚕品种,显著提高了家蚕茧丝的机械性能,并证明了丝纤维的机械性能与组成其蛋白分子量之间呈极显著的线性关系,为进一步改良蚕丝质量奠定了坚实的基础。本研究结果揭示了如果能够对家蚕丝腺细胞基因表达特征进行改良,能够提高外源蛋白蜘蛛丝的表达量,同时导入分子量更大的蜘蛛丝基因,就能够进一步提高蚕丝的机械性能。
【关键词】：家蚕 后部丝腺 转录组 蛋白质组 piggyBac 转基因 黑寡妇蜘蛛牵引丝 纤维机械性能
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;S881.2
【目录】：

• 致谢(Acknowledgements)6-10
• 摘要10-12
• Abstract12-15
• 第1章 文献综述15-36
• 1.1 家蚕丝腺与丝的研究背景15-23
• 1.1.1 丝腺的研究进展15-18
• 1.1.2 家蚕茧丝及其突变品种的研究18-21
• 1.1.3 丝腺的蛋白质组学的研究21-22
• 1.1.4 蚕丝的应用22-23
• 1.2 家蚕转基因技术研究进展23-26
• 1.3 蜘蛛丝研究进展26-32
• 1.3.1 蜘蛛丝种类、结构及性能研究26-31
• 1.3.2 蜘蛛丝蛋白的表达研究31-32
• 1.3.3 蜘蛛丝的应用前景32
• 1.4 采用转基因技术改造蚕丝强度的研究进展32-33
• 1.5 研究的目的意义、内容及技术路线33-36
• 1.5.1 研究目的及意义33-34
• 1.5.2 研究内容34-35
• 1.5.3 技术路线35-36
• 第2章 家蚕不同突变品种后部丝腺转录组的分析36-62
• 2.1 引言36-37
• 2.2 试验材料37
• 2.3 试验方法37-43
• 2.3.1 家蚕后部丝腺的解剖37
• 2.3.2 总RNA的提取37-38
• 2.3.3 转录组测序(RNA-seq)38-40
• 2.3.4 生物信息学的分析40-42
• 2.3.5 荧光定量PCR42-43
• 2.4 结果43-58
• 2.4.1 总RNA的提取43-44
• 2.4.2 数据的基本分析44-46
• 2.4.3 差异基因的分析46-53
• 2.4.4 差异基因GO(Gene Ontology)的分析53-56
• 2.4.5 差异基因KEGG的分析56-57
• 2.4.6 荧光定量PCR(Q-PCR)分析家蚕后部丝腺主要基因的表达57-58
• 2.5 讨论58-62
• 第3章 家蚕不同突变品种后部丝腺蛋白质谱的分析62-89
• 3.1 引言62
• 3.2 试验材料62
• 3.3 试验方法62-68
• 3.3.1 家蚕后部丝腺的解剖62
• 3.3.2 蛋白质组的表达谱(iTRAQ)62-66
• 3.3.3 生物信息学分析66-68
• 3.4 结果68-83
• 3.4.1 鉴定质量的评估及蛋白质鉴定68-71
• 3.4.2 差异蛋白质的鉴定71-79
• 3.4.3 差异蛋白功能Gene Ontology(GO)分类的分析79-81
• 3.4.4 差异蛋白KEGG分析81-83
• 3.5 转录组及蛋白质组之间的比较分析83-84
• 3.6 讨论84-89
• 第4章 转蜘蛛丝蛋白改良家蚕茧丝机械性能的研究89-146
• 4.1 引言89-90
• 4.2 材料和方法90-110
• 4.2.1 试验材料90
• 4.2.2 质粒、菌种及主要试剂90-91
• 4.2.3 主要溶液及其配制91-95
• 4.2.4 试验方法95-110
• 4.3 结果与分析110-144
• 4.3.1 转基因家蚕类蜘蛛丝载体的设计及组装110-117
• 4.3.2 阳性转基因家蚕的筛选与转基因阳性率统计117-121
• 4.3.3 不同转基因系家蚕插入位点的分析121-129
• 4.3.4 外源蜘蛛丝蛋白表达鉴定129-132
• 4.3.5 茧丝机械性能的分析132-138
• 4.3.6 重组蜘蛛丝蛋白的大小与机械性能之间的关系138-142
• 4.3.7 共表达重组MaSp1和MaSp2蛋白机械性能分析142-144
• 4.4 讨论144-146
• 第5章 全文总结、创新点和研究展望146-149
• 5.1 全文总结146-148
• 5.2 创新点148
• 5.3 研究展望148-149
• 附件149-164
• 参考文献164-171
• 攻读博士期间的研究成果171-173
• 博士期间参加的学术会议173

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 张阳;赵爱春;陈雪娇;鲁成;向仲怀;;一种新的单根茧丝纤维横截面积测量方法[J];蚕业科学;2011年05期

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本文编号：392959