新型抗菌糖肽-sublancin的增量表达及其生物学活性研究

发布时间：2017-05-25 07:25

  本文关键词：新型抗菌糖肽-sublancin的增量表达及其生物学活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：抗生素滥用所造成的残留已严重影响到人类的健康和畜牧业的可持续健康发展,开展抗生素替代品-抗菌肽的研究备受国内外的高度关注。来源于天然抗菌肽及其衍生的杂合抗菌肽因具有高效广谱的抗病毒、抗真菌、抗细菌及抑制癌细胞等生物学功能,以及在体内代谢速度快,无残留,不破坏正常细胞的完整性和生物学活性等特性,因而,深入开展新型抗菌肽研究的意义十分重大。由于不同来源的抗菌肽结构不同,因而采用化学合成法合成的难易程度也不同。从枯草芽孢杆菌168菌株(Bacillus subtilis 168 strain)中分离而来的新型抗菌糖肽-sublancin,具有2个二硫键结构和1个因在翻译后被再次修饰而形成的S-连接糖基团结构。sublancin因具有特殊结构而导致其不易通过正常的化学合成法来合成。通过对sublancin来源菌在染色体水平上进行改造来提高sublancin产率是一个可大量获取sublancin的可行方法。在本研究中,选用枯草芽孢杆菌168菌株(也含有合成sublancin成熟肽相关基因的枯草芽孢杆菌1A747菌株)作为sublancin增量表达的出发菌株。为了提高新型糖肽-sublancin的产率,本研究中在染色体水平上构建了重组枯草芽孢杆菌1A747菌株(被命名为枯草芽孢杆菌ZQSY菌株),并通过响应面方法在摇瓶水平上对重组枯草芽孢杆菌ZQSY菌株的培养基配方和发酵条件进行了优化。随后测定了经纯化的sublancin对一些常见致病菌的抑菌活性和在特定条件下的稳定性。最后,应用sublancin对动物模型—昆明小鼠的口服急性毒性试验和生物利用度试验,评估了sublancin经口服饲喂试验动物后可能存在的风险。本研究结果如下:1、采用化学法合成了3条与形成sublancin成熟肽相关的基因(串)(sun I、sun A和sun T bdb A sun S bdb B),并分别在它们的5’端引入了具有不同转录特点且转录活性强的启动子P43、Pglv和Plux S,在此基础上构建了枯草芽孢杆菌同源重组表达载体p DM036。之后,p DM036同源重组进入枯草芽孢杆菌1A747菌株里的SPβ染色体中得到了可增量表达sublancin的重组枯草芽孢杆菌1A747菌株(将其命名为枯草芽孢杆菌ZQSY菌株),在摇瓶水平上对其进行发酵,并使用tricine SDS PAGE检测发酵液上清蛋白表达情况。结果表明,在分析泳道3.8 k Da的位置上存在着明显的蛋白条带,采用免疫印迹杂交分析试验(western blotting analysis)验证了该蛋白确实为sublancin的蛋白条带。应用高效液相反相色谱法(reversed phase high performance liquid chromatography,RP HPLC)及紫外分光光度法分析表明,每升摇瓶发酵液的上清中可获得642 mg的sublancin样品。2、在重组枯草芽孢杆菌ZQSY菌株的基础上和摇瓶培养条件下,使用响应面优化法进一步提高sublancin的产率。首先采用Design expert 8.0.5b软件中的Plackett-Burman模块筛选对发酵重组枯草芽孢杆菌ZQSY菌株生产sublancin影响比较大的因子,试验结果表明具有显著作用(P0.05)的影响因子分别为玉米粉、豆粕粉和培养温度。经最陡爬坡试验后,最终应用响应面分析中的Box-Behnken Design(BBD)筛选法确定了这3个影响因子的最佳条件:玉米粉28.46 g/L、豆粕粉23.05 g/L、培养温度为30.9°C。在此培养条件下,sublancin最高产率的理论预测值为887.62 mg/L,与在该条件下对重组枯草芽孢杆菌ZQSY菌株进行培养得到的896.8 mg/L sublancin的实得产率基本吻合。在5 L发酵罐中,采取摇瓶条件下筛选到的最优培养条件对重组菌株进行培养,sublancin的产率被进一步提高到了968 mg/L。3、将重组枯草芽孢杆菌ZQSY菌株在5 L发酵罐中经一系列发酵和纯化流程后所得到的sublancin样品应用于后续试验之中。抑菌试验结果表明,sublancin样品对化脓性链球菌和金黄色葡萄球菌等9种常见的耐药或非耐药的指示菌表现出了不同程度的抑菌活性,其中对耐加氧西林金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)为0.4±0.21 mg/L,抑菌效果最显著。稳定性试验表明,60°C以下的温度处理30 min对sublancin的抑菌活性影响不明显,80°C以上温度处理30 min会显著降低sublancin的抑菌活性。p H波动范围在4.0~9.0时sublancin的抑菌活性可稳定维持在较高水平,当p H≤4.0时sublancin的抑菌活性显著下降。在胃蛋白酶、人中性粒细胞弹性蛋白酶、铜绿假单胞菌弹性蛋白酶、金黄色葡萄球菌V8蛋白酶和胰蛋白酶的作用下,sublancin的抑菌活性几乎不受影响。4、以昆明小鼠为动物试验模型,对sublancin可能会在动物体内所产生的危害进行了初步检测。Sublancin对雌雄各半的昆明小鼠口服急性毒性试验的试验结果表明,sublancin单次口服剂量不高于5000 mg/kg/d时不会对昆明小鼠包括胃脏在内的内脏器官造成伤害,也不会引起体内受检测的血液生化指标发生超正常范围的变化。生物利用度试验的结果表明,sublancin不会以其完整形式进入昆明小鼠体内。这些结果表明sublancin经口服进入试验动物胃肠道内给动物健康生产造成安全风险的可能性很低。
【关键词】：sublancin 抗菌糖肽 枯草芽孢杆菌 产率 抑菌活性
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S859.79
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 上篇 文献综述13-41
• 第一章 抗菌肽的研究现状与进展13-32
• 1.1 抗菌肽的发现13-14
• 1.2 抗菌肽的来源及种类14-22
• 1.2.1 具有螺旋结构的线性抗菌肽15-16
• 1.2.2 富含特定氨基酸的线性抗菌肽16-17
• 1.2.3 具有一个二硫键的抗菌肽17
• 1.2.4 具有两个或多个二硫键的抗菌肽17-18
• 1.2.5 含羊毛硫及其它结构的抗菌肽18
• 1.2.6 合成sublancin的相关基因及其结构特点18-22
• 1.3 抗菌肽的作用特点22-24
• 1.4 抗菌肽的作用机制24-28
• 1.5 抗菌肽在不同领域的应用前景及其存在的问题28-32
• 1.5.1 抗菌肽在生物医药领域的应用28-29
• 1.5.2 抗菌肽在食品防腐领域的应用29
• 1.5.3 抗菌肽在农业病害防控领域的应用29-31
• 1.5.4 抗菌肽在应用中所存在的问题31-32
• 第二章 枯草芽孢杆菌表达系统32-41
• 2.1 枯草芽孢杆菌表达系统的特点及研究进展32
• 2.2 基因在枯草芽孢杆菌中表达所需的组件32-33
• 2.2.1 多 δ 因子32
• 2.2.2 启动子32-33
• 2.2.3 终止子33
• 2.3 蛋白质在枯草芽孢杆菌中的分泌33-35
• 2.4 枯草芽孢杆菌提高基因表达量的影响因素35-37
• 2.4.1 密码子的选取36
• 2.4.2 目的基因的拷贝数36
• 2.4.3 载体的选用36
• 2.4.4 枯草芽孢杆菌的培养条件36-37
• 2.4.5 启动子的强弱37
• 2.4.6 翻译起始的效率37
• 2.5 枯草芽孢杆菌表达体系中所存在的问题及发展方向37-38
• 2.6 本研究的目的和意义38-40
• 2.7 本研究的技术路线40-41
• 下篇 试验研究41-81
• 第三章 新型抗菌糖肽SUBLANCIN在枯草芽孢杆菌里的增量表达41-51
• 3.1 引言41
• 3.2 材料和方法41-45
• 3.2.1 重组枯草芽孢杆菌ZQSY菌株的构建41-43
• 3.2.2 总RNA的分离和实时定量PCR43-44
• 3.2.3 蛋白杂交44
• 3.2.4 sublancin的纯化44-45
• 3.3 结果45-49
• 3.3.1 重组枯草芽孢杆菌ZQSY菌株的构建45
• 3.3.2 重组枯草芽孢杆菌ZQSY菌株的摇瓶水平发酵45
• 3.3.3 sublancin成熟肽的增量生物合成45-49
• 3.4 讨论49-50
• 3.5 小结50-51
• 第四章 响应面法提升重组枯草芽孢杆菌ZQSY菌株合成SUBLANCIN的产率分析51-65
• 4.1 引言51
• 4.2 材料和方法51-57
• 4.2.1 材料51
• 4.2.2 细菌菌株和发酵条件51-52
• 4.2.3 碳源和氮源的筛选52
• 4.2.4 Plackett-Burman设计52-55
• 4.2.5 最陡爬坡试验55
• 4.2.6 响应面试验方法55-56
• 4.2.7 使用 5 L发酵罐进行分批发酵试验56-57
• 4.2.8 数据处理方法57
• 4.3 结果与讨论57-64
• 4.3.1 最优碳源和氮源的筛选57
• 4.3.2 Plackett-Burman设计57-59
• 4.3.3 最陡爬坡试验59
• 4.3.4 Box-Behnken设计59-61
• 4.3.5 摇瓶水平上的模型验证61-62
• 4.3.6 发酵罐水平的模型验证62
• 4.3.7 玉米粉和豆粕粉对sublancin产率的影响62-64
• 4.4 小结64-65
• 第五章 SUBLANCIN的结构分析及生物学活性与稳定性测定65-74
• 5.1 引言65
• 5.2 材料与方法65-67
• 5.2.1 sublancin二级结构分析65
• 5.2.2 sublancin的抑菌活性试验65-66
• 5.2.3 sublancin对HT-29细胞的裂解活性66
• 5.2.4 sublancin稳定性测定66-67
• 5.2.5 数据统计分析67
• 5.3 结果67-71
• 5.3.1 sublancin结构分析67-69
• 5.3.2 sublancin在不同条件下的稳定性测定69-71
• 5.3.3 sublancin对多种细菌的抑菌活性和细胞毒性71
• 5.4 讨论71-73
• 5.5 小结73-74
• 第六章 SUBLANCIN对昆明小鼠的.服毒性评估74-81
• 6.1 引言74
• 6.2 材料与方法74-77
• 6.2.1 sublancin样品准备74
• 6.2.2 试验动物74
• 6.2.3.服急性毒性试验74-77
• 6.2.4.服生物利用度77
• 6.2.5 血液样品中sublancin浓度的测定77
• 6.2.6 统计分析77
• 6.3 结果77-79
• 6.3.1.服急性毒性试验77-79
• 6.3.2.服生物利用度79
• 6.4 讨论79-80
• 6.5 小结80-81
• 研究结论81-82
• 创新点82-83
• 需要进一步研究的问题83-84
• 参考文献84-95
• 附录95-100
• 致谢100-101
• 作者简介101

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