藏羊初级毛囊发育诱导期分子调控网络和候选基因转录调控机制研究
发布时间：2025-01-09 04:32
藏羊是我国典型的粗毛羊品种,其羊毛以初级毛囊形成的髓状毛为主,是优质的地毯毛来源,目前关于地毯毛性状的遗传机制报道较少。胚胎发育过程中,表皮细胞与真皮细胞的信号分子之间相互作用,诱导皮肤细胞增殖分化形成初级毛囊。分析藏羊初级毛囊诱导形成过程中的分子调控网络,筛选参与调控初级毛囊诱导形成的关键基因,挖掘地毯毛性状相关的种质资源,对提高羊毛品质具有重要意义。本研究通过转录组测序分析藏羊初级毛囊发育诱导期的长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）和信使RNA（messenger RNA,mRNA）的分子调控网络,解析初级毛囊早期发育过程中相互作用的关键激活因子EDAR和抑制因子BMP4的转录调控机制,阐明其诱导藏羊初级毛囊形成的潜在分子机制。具体结果如下:1.藏羊初级毛囊发育诱导期关键lncRNAs和mRNAs的筛选和鉴定通过组织形态学分析藏羊胚胎的皮肤结构发现初级毛囊诱导形成时期（stage 1）相比于诱导形成前时期（stage 0）,皮肤的表皮和真皮明显增厚,并形成毛囊基板和真皮凝集体。通过分析藏羊初级毛囊诱导形成前后皮肤转录组测序数据鉴定到36个显著上调的...
【文章页数】：123 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第一章 综述
1 前言
2 毛囊的发育及其分期
3 调控毛囊发育的关键信号通路
3.1 WNT信号通路在毛囊发育中的研究进展
3.2 EDAR信号通路在毛囊发育中的研究进展
3.3 BMP信号通路在毛囊发育中的研究进展
3.4 FGF信号通路在毛囊发育中的研究进展
3.5 初级毛囊发育诱导期EDAR和 BMPs的互作
4 非编码RNA在毛囊发育中的研究进展
4.1 miRNA在毛囊发育中的研究进展
4.2 LncRNA在毛囊发育中的研究进展
5 基因的转录调控机制
5.1 启动子区的转录调控
5.2 miRNA对基因的转录后调控作用
6 研究目的和意义
第二章 材料与方法
1 试验材料
1.1 试验样品
1.2 主要仪器与设备
1.3 主要试剂和试剂盒
1.4 主要试剂配制
1.5 细胞系和载体
1.6 主要的生物信息学网站和分析软件
2 试验方法
2.1 皮肤形态学分析
2.1.1 石蜡切片
2.1.2 苏木精&伊红(Hematoxylin and eosin,H&E)染色
2.2 总RNA提取和c DNA合成
2.2.1 总RNA提取
2.2.2 cDNA反转录
2.3 基因组DNA的提取
2.4 转录组测序和生物信息学分析
2.4.1 RNA质量检测、cDNA文库构建和测序
2.4.2 测序数据质量检测和序列比对组装
2.4.3 LncRNA的筛选和鉴定
2.4.4 LncRNA与mRNA的结构比较
2.4.5 LncRNA和mRNA的表达水平分析
2.4.6 LncRNA靶基因预测
2.4.7 LncRNA和 mRNA的功能富集分析
2.4.8 互作网络分析
2.5 qRT-PCR
2.6 切片原位杂交
2.6.1 候选lncRNA的克隆
2.6.2 原位杂交探针制备
2.6.3 切片原位杂交
2.7 候选基因启动子缺失载体的构建
2.8 候选基因启动子活性分析
2.8.1 细胞的复苏、培养、冻存和转染
2.8.2 双荧光素酶活性的检测
2.9 候选基因核心启动子的转录因子结合位点预测
2.10 转录因子结合位点突变载体的构建
2.11 转录因子结合位点突变载体的双荧光素酶活性检测
2.12 转录因子超表达载体的构建
2.13 核心启动子区质粒与转录因子超表达质粒共转染细胞
2.14 转录因子的超表达
2.15 与候选基因3’UTR结合的miRNA预测
2.16 候选基因3’UTR双荧光素酶报告载体的构建
2.17 候选基因3’UTR突变型双荧光素酶报告载体的构建
2.18 miRNA与候选基因结合位点的验证
2.19 miRNA对候选基因表达水平的影响
第三章 结果与分析
1 藏羊初级毛囊发育诱导期关键lncRNAs、mRNAs的筛选和鉴定
1.1 藏羊初级毛囊发育诱导期皮肤形态学分析
1.2 藏羊初级毛囊发育诱导期皮肤转录组测序和生物信息学分析
1.2.1 测序数据质量
1.2.2 参考序列比对
1.2.3 样品间相关性分析
1.2.4 候选lncRNAs和mRNAs的筛选
1.2.5 LncRNAs与mRNAs的结构比较
1.2.6 差异表达lncRNAs与mRNAs的鉴定
1.2.7 差异表达lncRNAs靶基因与差异表达mRNAs GO分析
1.2.8 差异表达lncRNAs靶基因与差异表达mRNAs KEGG分析
1.2.9 差异表达mRNA-mRNA、lncRNA-mRNA的互作网络分析
1.3 qRT-PCR检测藏羊初级毛囊发育诱导期关键lncRNAs的表达水平
1.4 切片原位杂交检测藏羊XLOC297809和XLOC764219的表达
1.5 qRT-PCR检测藏羊初级毛囊发育诱导期关键基因的表达水平
1.5.1 qRT-PCR检测WNT信号通路中差异基因的表达水平
1.5.2 qRT-PCR检测EDAR信号通路中差异基因的表达水平
1.5.3 qRT-PCR检测BMP信号通路中差异基因的表达水平
1.5.4 qRT-PCR检测其它关键差异基因的表达水平
2 藏羊EDAR基因的转录调控机制研究
2.1 藏羊EDAR启动子区的转录调控机制
2.1.1 EDAR启动子缺失载体构建
2.1.2 EDAR启动子活性分析
2.1.3 EDAR启动子进一步缺失载体构建
2.1.4 EDAR启动子活性进一步分析
2.1.5 EDAR核心启动子的转录因子结合位点预测
2.1.6 EDAR核心启动子的转录因子结合位点定点突变
2.1.7 超表达ETS1对EDAR启动子活性的影响
2.1.8 超表达ETS1对EDAR基因表达水平的影响
2.2 miRNA对藏羊EDAR基因表达的调控
2.2.1 与EDAR基因3’UTR结合的miRNA预测
2.2.2 miR-125a-5p和 miR-24-3p的成熟序列保守性分析
2.2.3 EDAR基因3’UTR与miRNA的结合位点分析
2.2.4 双荧光素酶报告系统验证
2.2.5 miR-125a-5p对 EDAR基因表达水平的影响
3 藏羊BMP4基因的转录调控机制研究
3.1 藏羊BMP4启动子区的转录调控机制
3.1.1 BMP4启动子缺失载体构建
3.1.2 BMP4启动子活性分析
3.1.3 BMP4核心启动子的转录因子结合位点预测
3.1.4 BMP4核心启动子的转录因子结合位点定点突变
3.1.5 超表达MYC和SP1对BMP4启动子活性的影响
3.1.6 超表达MYC和SP1对BMP4基因表达水平的影响
3.2 miRNA对藏羊BMP4基因表达的调控
3.2.1 与BMP4基因3’UTR结合的miRNA预测
3.2.2 miR-340-5p的成熟序列保守性分析
3.2.3 BMP4 基因3’UTR与miRNA的结合位点分析
3.2.4 双荧光素酶报告系统验证
3.2.5 miR-340-5p对BMP4基因表达水平的影响
第四章 讨论
1 藏羊初级毛囊发育诱导期形态学分析
2 调控藏羊初级毛囊诱导形成的关键mRNAs
3 调控藏羊初级毛囊诱导形成的关键lncRNAs
4 调控藏羊初级毛囊诱导形成的候选基因的选择
5 候选基因的转录调控机制研究
6 调控藏羊初级毛囊诱导形成的候选lncRNAs、基因、转录因子和miRNAs
第五章 结论
1 主要结论
2 主要创新点
参考文献
发表论文
致谢
本文编号：4025155
【文章页数】：123 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第一章 综述
1 前言
2 毛囊的发育及其分期
3 调控毛囊发育的关键信号通路
3.1 WNT信号通路在毛囊发育中的研究进展
3.2 EDAR信号通路在毛囊发育中的研究进展
3.3 BMP信号通路在毛囊发育中的研究进展
3.4 FGF信号通路在毛囊发育中的研究进展
3.5 初级毛囊发育诱导期EDAR和 BMPs的互作
4 非编码RNA在毛囊发育中的研究进展
4.1 miRNA在毛囊发育中的研究进展
4.2 LncRNA在毛囊发育中的研究进展
5 基因的转录调控机制
5.1 启动子区的转录调控
5.2 miRNA对基因的转录后调控作用
6 研究目的和意义
第二章 材料与方法
1 试验材料
1.1 试验样品
1.2 主要仪器与设备
1.3 主要试剂和试剂盒
1.4 主要试剂配制
1.5 细胞系和载体
1.6 主要的生物信息学网站和分析软件
2 试验方法
2.1 皮肤形态学分析
2.1.1 石蜡切片
2.1.2 苏木精&伊红(Hematoxylin and eosin,H&E)染色
2.2 总RNA提取和c DNA合成
2.2.1 总RNA提取
2.2.2 cDNA反转录
2.3 基因组DNA的提取
2.4 转录组测序和生物信息学分析
2.4.1 RNA质量检测、cDNA文库构建和测序
2.4.2 测序数据质量检测和序列比对组装
2.4.3 LncRNA的筛选和鉴定
2.4.4 LncRNA与mRNA的结构比较
2.4.5 LncRNA和mRNA的表达水平分析
2.4.6 LncRNA靶基因预测
2.4.7 LncRNA和 mRNA的功能富集分析
2.4.8 互作网络分析
2.5 qRT-PCR
2.6 切片原位杂交
2.6.1 候选lncRNA的克隆
2.6.2 原位杂交探针制备
2.6.3 切片原位杂交
2.7 候选基因启动子缺失载体的构建
2.8 候选基因启动子活性分析
2.8.1 细胞的复苏、培养、冻存和转染
2.8.2 双荧光素酶活性的检测
2.9 候选基因核心启动子的转录因子结合位点预测
2.10 转录因子结合位点突变载体的构建
2.11 转录因子结合位点突变载体的双荧光素酶活性检测
2.12 转录因子超表达载体的构建
2.13 核心启动子区质粒与转录因子超表达质粒共转染细胞
2.14 转录因子的超表达
2.15 与候选基因3’UTR结合的miRNA预测
2.16 候选基因3’UTR双荧光素酶报告载体的构建
2.17 候选基因3’UTR突变型双荧光素酶报告载体的构建
2.18 miRNA与候选基因结合位点的验证
2.19 miRNA对候选基因表达水平的影响
第三章 结果与分析
1 藏羊初级毛囊发育诱导期关键lncRNAs、mRNAs的筛选和鉴定
1.1 藏羊初级毛囊发育诱导期皮肤形态学分析
1.2 藏羊初级毛囊发育诱导期皮肤转录组测序和生物信息学分析
1.2.1 测序数据质量
1.2.2 参考序列比对
1.2.3 样品间相关性分析
1.2.4 候选lncRNAs和mRNAs的筛选
1.2.5 LncRNAs与mRNAs的结构比较
1.2.6 差异表达lncRNAs与mRNAs的鉴定
1.2.7 差异表达lncRNAs靶基因与差异表达mRNAs GO分析
1.2.8 差异表达lncRNAs靶基因与差异表达mRNAs KEGG分析
1.2.9 差异表达mRNA-mRNA、lncRNA-mRNA的互作网络分析
1.3 qRT-PCR检测藏羊初级毛囊发育诱导期关键lncRNAs的表达水平
1.4 切片原位杂交检测藏羊XLOC297809和XLOC764219的表达
1.5 qRT-PCR检测藏羊初级毛囊发育诱导期关键基因的表达水平
1.5.1 qRT-PCR检测WNT信号通路中差异基因的表达水平
1.5.2 qRT-PCR检测EDAR信号通路中差异基因的表达水平
1.5.3 qRT-PCR检测BMP信号通路中差异基因的表达水平
1.5.4 qRT-PCR检测其它关键差异基因的表达水平
2 藏羊EDAR基因的转录调控机制研究
2.1 藏羊EDAR启动子区的转录调控机制
2.1.1 EDAR启动子缺失载体构建
2.1.2 EDAR启动子活性分析
2.1.3 EDAR启动子进一步缺失载体构建
2.1.4 EDAR启动子活性进一步分析
2.1.5 EDAR核心启动子的转录因子结合位点预测
2.1.6 EDAR核心启动子的转录因子结合位点定点突变
2.1.7 超表达ETS1对EDAR启动子活性的影响
2.1.8 超表达ETS1对EDAR基因表达水平的影响
2.2 miRNA对藏羊EDAR基因表达的调控
2.2.1 与EDAR基因3’UTR结合的miRNA预测
2.2.2 miR-125a-5p和 miR-24-3p的成熟序列保守性分析
2.2.3 EDAR基因3’UTR与miRNA的结合位点分析
2.2.4 双荧光素酶报告系统验证
2.2.5 miR-125a-5p对 EDAR基因表达水平的影响
3 藏羊BMP4基因的转录调控机制研究
3.1 藏羊BMP4启动子区的转录调控机制
3.1.1 BMP4启动子缺失载体构建
3.1.2 BMP4启动子活性分析
3.1.3 BMP4核心启动子的转录因子结合位点预测
3.1.4 BMP4核心启动子的转录因子结合位点定点突变
3.1.5 超表达MYC和SP1对BMP4启动子活性的影响
3.1.6 超表达MYC和SP1对BMP4基因表达水平的影响
3.2 miRNA对藏羊BMP4基因表达的调控
3.2.1 与BMP4基因3’UTR结合的miRNA预测
3.2.2 miR-340-5p的成熟序列保守性分析
3.2.3 BMP4 基因3’UTR与miRNA的结合位点分析
3.2.4 双荧光素酶报告系统验证
3.2.5 miR-340-5p对BMP4基因表达水平的影响
第四章 讨论
1 藏羊初级毛囊发育诱导期形态学分析
2 调控藏羊初级毛囊诱导形成的关键mRNAs
3 调控藏羊初级毛囊诱导形成的关键lncRNAs
4 调控藏羊初级毛囊诱导形成的候选基因的选择
5 候选基因的转录调控机制研究
6 调控藏羊初级毛囊诱导形成的候选lncRNAs、基因、转录因子和miRNAs
第五章 结论
1 主要结论
2 主要创新点
参考文献
发表论文
致谢
本文编号：4025155
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/nykjbs/4025155.html
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