猪瘟病毒流行毒株糖蛋白E2高变区氨基酸置换对疫苗C株获得性免疫应答的影响

发布时间：2017-05-29 08:09

  本文关键词：猪瘟病毒流行毒株糖蛋白E2高变区氨基酸置换对疫苗C株获得性免疫应答的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪瘟是具有高度传染性的病毒性疾病,是养猪业危害最严重的疾病之一。其病原为猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV),该病毒为具有囊膜的正链RNA病毒,基因组长度大约12.3 kb,包含5’和3’端非翻译区,编码一条含有3898个氨基酸的肽链,能够被剪切为12个蛋白,其中4个为结构蛋白(C、Erns、E1和E2)和8个为非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。在结构蛋白中,E2被认为是CSFV的主要保护性抗原。基于E2基因的CSFV基因分型结果显示,流行毒株已经从基因型1转变为基因型2,表明主要抗原基因正在逐步发生变异。有研究表明,E2蛋白单点氨基酸的突变可能影响E2蛋白的抗原性,进而改变E2蛋白与抗体反应性,大部分影响中和反应差异性的重要抗原特异性氨基酸残基位于B/C抗原结构域上。然而,有关E2基因变异是否影响CSFV弱毒疫苗的免疫效果鲜见研究。本研究试图通过原核和杆状病毒系统表达基于流行毒株E2高变区AR3的突变蛋白,系统分析它们与疫苗C株高免血清的反应性及其对C株免疫猪外周血单核细胞的激活效应,以此阐明流行毒株E2蛋白变异对C株疫苗免疫效果的潜在影响。原核表达属于基因2型CSFV流行毒株QZ-07与HZ1-08的E2抗原结构域(AD和BC区),与疫苗C株免疫的猪血清反应性显著低于相同区域的C株E2片段(P0.05)。通过基因1型和2型E2蛋白分析发现,E2抗原结构域包含3个高变抗原区(Antigenic region, AR)。我们通过对商业的杆状病毒表达系统进行改造,制备了疫苗C株、流行毒株QZ-07和HZl-08不包含跨膜区的截短E2蛋白,以及以C株E2为骨架分别嵌合流行毒株3个AR区的重组嵌合蛋白。ELISA和免疫印迹分析结果显示,C株E2嵌合流行毒株AR3的重组蛋白在所有重组嵌合蛋白中反应性最差(P0.05)。另外,为了检验流行毒株E2不同抗原区对C株疫苗免疫产生的细胞介导免疫影响,我们用不同的重组E2蛋白刺激C株疫苗免疫的猪外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)。通过ELISPOT和流式细胞术分析,我们发现C株E2嵌合不同流行毒株抗原区的重组蛋白在刺激PBMC分泌抗体和分泌IFN-γ能力上没有显著的区别。上述结果表明,E2蛋白主要诱导体液免疫,C株疫苗血清与基因2型流行毒株的E2蛋白反应性有显著差别,这种差别可能主要来自于AR3的变异。为了进一步探索AR3的变异在E2蛋白与C株疫苗诱导的体液免疫之间的关系,我们选取了AR3区的10个差异显著的氨基酸位点,利用杆状病毒表达系统制备了以C株E2为骨架、分别携带流行毒株单一氨基酸置换的10个突变E2蛋白。免疫印迹结果显示,不同突变蛋白之间及其与C株E2蛋白之间对C株血清的反应性差异并不明显。ELISA分析结果表明,相对于C株E2蛋白所有重组突变蛋白与C株免疫猪血清反应能力都有降低,其中以E37N和V45Q(以AR3区域的氨基酸位置)反应能力降低更为显著(P0.05),表明这两个氨基酸可能与E2蛋白的构象相关。以上结果表明,基因型2的流行毒株E2蛋白抗原区变异影响其对C株疫苗的血清反应性,其中以AR3区的影响尤为明显；AR3区的E37N和V45Q两个位点置换显著降低其与C株高免血清的反应性,表明这些氨基酸可能介导了E2蛋白的构象变化。本研究结果为猪瘟疫苗的改良和基于E2蛋白亚单位疫苗的研制提供了基础。
【关键词】：猪瘟病毒 E2蛋白 抗原区 流行毒株
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要10-12
• ABSTRACT12-15
• 第一部分 文献综述15-37
• 第一章 猪瘟病毒的生物学特征及其编码蛋白功能16-30
• 1 生物学特征16-18
• 2 流行情况18-20
• 3 病毒编码蛋白功能20-30
• 3.1 结构蛋白21-24
• 3.2 非结构蛋白24-30
• 第二章30-36
• 2 E2亚单位疫苗及其保护效力30-32
• 3 影响E2亚单位疫苗免疫效力的因素32-34
• 3.1 E2蛋白变异32-34
• 3.2 母源抗体34
• 4 控制猪瘟病毒感染面临的主要问题34-36
• 本研究的目的和意义36-37
• 第二部分 试验研究37-87
• 第三章 杆状病毒表达猪瘟病毒C株E2嵌合流行毒株E2高变区重组蛋白38-54
• 摘要38-39
• 1 材料39-40
• 1.1 菌株、细胞和培养条件39
• 1.2 主要试剂和仪器39-40
• 2 方法40-47
• 2.1 pFastBac~(TM)HT B载体改造40-41
• 2.2 携带E2基因的pFastHTB-M1重组质粒构建41-42
• 2.3 重组E2蛋白杆状病毒基因组构建42-43
• 2.4 表达E2蛋白的重组杆状病毒制备43-44
• 2.5 重组E2蛋白纯化44-45
• 2.6 SDS-PAGE/免疫印迹45-47
• 3 结果47-52
• 3.1 pFastBac~(TM)HT B改造载体鉴定47-48
• 3.2 携带E2基因pFastHTB-M1重组质粒鉴定48-49
• 3.3 重组E2蛋白杆状病毒基因组鉴定49-50
• 3.4 重组E2杆状病毒制备50
• 3.5 重组E2蛋白纯化与鉴定50-52
• 4 讨论52-54
• 第四章 猪瘟病毒流行毒株E2抗原区对C株诱导的免疫反应性影响54-68
• 摘要54-55
• 1 材料55
• 1.1 动物、细胞和养殖及培养条件55
• 1.2 主要试剂和仪器55
• 2 方法55-60
• 2.1 C株疫苗免疫血清及外周血单核细胞分离55-56
• 2.2 ELISA56-57
• 2.3 免疫印迹57
• 2.4 外周血单核细胞抗体分泌水平检测57-58
• 2.5 外周血单核细胞IFN-γ分泌水平检测58-60
• 3 结果60-66
• 3.1 携带流行毒株E2高变区重组蛋白与C株高免血清反应性60-62
• 3.2 携带流行毒株E2高变区重组蛋白对PBMC抗体水平分泌的影响62-63
• 3.3 携带流行毒株E2高变区重组蛋白对PBMC分泌IFN-γ的影响63-66
• 4 讨论66-68
• 第五章 猪瘟病毒C株E2置换流行毒株高变区差异氨基酸对C株免疫猪血清反应性的影响68-87
• 摘要68
• 1 材料68-70
• 1.1 动物、毒株和细胞69
• 1.2 主要试剂和仪器69-70
• 2 方法70-78
• 2.1 流行毒株高变区AR3差异氨基酸位点分析70-72
• 2.2 基于C株E2的pFastHTB-M1-C-E2为骨架置换流行毒株高变区氨基酸72
• 2.3 置换流行毒株高变区氨基酸的重组E2蛋白杆状病毒基因组构建72-73
• 2.4 表达E2突变蛋白杆状病毒的制备73
• 2.5 重组蛋白表达与纯化73-76
• 2.6 突变蛋白与高免血清反应性分析76-78
• 3 结果78-85
• 3.1 流行毒株高变区AR3变异显著的氨基酸位点78-80
• 3.2 携带C株E2置换流行毒株AR3差异氨基酸的pFastHTB-M1载体鉴定80-82
• 3.3 突变C株E2基因的杆状病毒基因组和重组病毒鉴定82
• 3.4 重组E2蛋白鉴定82-83
• 3.5 流行毒株高变区氨基酸置换对E2蛋白与高免血清反应性的影响83-85
• 4 讨论85-87
• 结论和创新性87-88
• 附图88-93
• 参考文献93-107
• 作者简介107-108
• 致谢108

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