柔嫩艾美耳球虫端粒酶逆转录酶互作蛋白的筛选及功能研究

发布时间：2017-05-30 13:07

  本文关键词：柔嫩艾美耳球虫端粒酶逆转录酶互作蛋白的筛选及功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：艾美耳球虫作为细胞内寄生虫，寄生于鸡肠道内引起是由以肠道病变为主要特征的鸡球虫病并严重危害养禽业的发展。目前控制球虫病还是主要依赖抗球虫药和疫苗的使用，但由于对球虫的细胞和分子生物学等缺乏详尽的了解，迄今尚无理想的控制鸡球虫病的药物和疫苗。端粒酶及相关蛋白的发现为深入研究球虫的细胞和分子生物学特性以及寻找新的防治鸡球虫的药物和疫苗作用靶位等开辟了新的研究领域。 端粒酶作为一种核糖核蛋白，由端粒酶逆转录酶(TERT)、端粒酶RNA和端粒酶相关蛋白三个亚单位组成，其以自身携带的RNA为模板，反转录合成新的端粒DNA重复序列以维持染色体端粒的稳定性。而TERT是具有催化活性的亚单位。随着对端粒酶研究的深入，先后报道了多种端粒酶相关蛋白，并发现这些蛋白在端粒酶活性调节过程中起重要作用。应用酵母双杂交筛选到的hTERT互作蛋白p23，与Hsp90共同在端粒酶的高效组装和活化中发挥作用。PinX能与hTERT的RNA结合域（326~620aa）结合，并也能结合端粒酶RNA，在酵母中hPinX同源物是一个酵母端粒酶功能负向调节因子。四膜虫p65和p45作为端粒酶的一部分在端粒维持方面发挥必要的作用。目前，柔嫩艾美耳球虫（E. tenella）的TERT序列已经成功克隆出来，而端粒-like序列已被预测出来。这些表明E. tenella利用传统的端粒酶机制合成其端粒DNA维持染色体末端的稳定。但尚无TERT相关蛋白的报道。故本研究通过酵母双杂交筛选、pull-down以及免疫共沉淀技术鉴定TERT互作蛋白14-3-3，进而利用病毒载体介导的锤头状核酶探讨14-3-3在端粒酶调节中的功能。 E. tenella酵母双杂交cDNA文库的构建：收集纯化E. tenella孢子化卵囊，Trizol提取总RNA并反转录成cDNA，使用SMART技术建立E. tenella酵母双杂交cDNA文库。文库滴度为5×107cfu/mL，容量为2×1010cfu。随机挑选的48个克隆菌插入片段平均大小0.8~2kb，文库重组率高。 E.tenella诱饵表达质粒pGBKT7-TRBD的构建及其互作蛋白的筛选：将PCR获得的E. tenella TERT RNA结合域（TRBD）片段与诱饵载体pGBKT7连接构建重组质粒pGBKT7-TRBD，并转化入酵母感受态细胞中。结果表明，诱饵蛋白能在酵母菌中表达且对宿主菌无毒性作用。-半乳糖苷酶试验表明诱饵蛋白无自激活作用。将pGBKT7-TRBD/Y187与酵母双杂交cDNA文库共培养筛选互作蛋白，初步筛选到了TRBD互作蛋白核仁素、14-3-3和尿苷磷酸化酶。-半乳糖苷酶试验表明14-3-3与TRBD间存在相互作用。 TRBD与14-3-3蛋白相互作用的鉴定：将TRBD和14-3-3基因分别克隆至原核表达载体pET-32a和pGEX-4T-1，并在大肠杆菌中进行原核表达和纯化。SDS-PAGE显示二者均能以可溶性蛋白的形式表达。将纯化的His-TRBD/GST-14-3-3共孵育，通过pull-down试验验证两种蛋白的相互作用。结果表明，E. tenella TRBD蛋白与14-3-3蛋白在体外具有相互作用。 构建真核表达质粒pcDNA-3.1-Myc-TRBD和pcDNA-3.1-HA-14-3-3，共转染293T细胞，Western blot显示Myc-TRBD和HA-14-3-3均能在293T细胞中表达。免疫共沉淀结果表明Myc-TRBD蛋白与HA-14-3-3蛋白在真核细胞内具有相互作用。 14-3-3蛋白的功能研究：设计合成针对14-3-3基因的的锤头状核酶并连接到E. tenella病毒载体上获得pEtV-RFP-Ham-14-3-3，进行体内和体外对14-3-3基因切割研究。体外试验表明pEtV-RFP-Ham-14-3-3体外转录体对14-3-3体外转录体切割效率达到85.24%。通过电转染方法，将pEtV-RFP-Ham-14-3-3体外转录体导入E. tenella体内，Western blot检测显示在球虫体内核酶对14-3-3基因具有一定的切割效率，14-3-3表达水平相对于RFP-GFP株下调11.24%。当14-3-3基因表达被抑制后，E. tenella端粒酶活性升高，初步表明14-3-3可能对于端粒酶活性具有负向调节的作用。 综上所述，本研究完成了E. tenella酵母双杂交cDNA文库的构建并筛选到了TERT相互作用蛋白14-3-3，pull-down和免疫共沉淀结果进一步证明了两种蛋白的相互作用。利用E. tenella病毒载体介导的核酶干扰了14-3-3在球虫体内的表达，从而初步表明14-3-3可能对于端粒酶活性具有负向调节的作用。本研究为深入探讨14-3-3调节端粒酶活性的机制以及寻找新的防治球虫病的药物和疫苗分子靶位奠定了重要基础。
【关键词】：柔嫩艾美耳球虫 酵母双杂交 TRBD 14-3-3 蛋白相互作用 核酶 端粒酶活性
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.31
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 英文缩写词表10-14
• 引言14-16
• 第一篇 文献综述16-38
• 第1章 鸡球虫分子生物学研究进展16-26
• 1 基因组学16-17
• 2 转录组学17-18
• 3 蛋白组学18-19
• 4 宿主细胞入侵19-21
• 5 鸡球虫分子生物学诊断方法21-24
• 6 球虫防控新方法24-26
• 第2章 端粒酶及相关蛋白研究进展26-32
• 1 端粒酶26-29
• 2 端粒酶相关蛋白29-32
• 第3章 原虫基因功能研究方法32-38
• 1 转染32-33
• 2 RNAi33-35
• 3 基因敲除35-36
• 4 核酶36-38
• 第二篇 研究内容38-94
• 第1章 E. tenella 酵母双杂交 cDNA 文库的构建38-49
• 1 材料与方法38-44
• 2 结果44-47
• 3 讨论47-48
• 4 小结48-49
• 第2章 E.tenella TERT 诱饵表达质粒的构建及其互作蛋白的筛选49-63
• 1 材料与方法49-56
• 2 结果56-61
• 3 讨论61-62
• 4 小结62-63
• 第3章 TERT 与 14-3-3 蛋白相互作用的鉴定63-77
• 1 材料与方法63-69
• 2 结果69-75
• 3 讨论75-76
• 4 小结76-77
• 第4章 14-3-3 蛋白的功能研究77-94
• 1 材料与方法77-85
• 2 结果85-91
• 3 讨论91-93
• 4 小结93-94
• 结论94-96
• 参考文献96-112
• 学术论文及发表情况112-114
• 导师简介114-116
• 作者简介116-118
• 致谢118

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 李先昆;聂智毅;曾日中;;酵母双杂交技术研究与应用进展[J];安徽农业科学;2009年07期

2 朱利军;长孙东亭;罗素兰;;全长cDNA文库构建方法及应用研究[J];海南大学学报(自然科学版);2009年02期

3 朱雅新,麻浩;端粒和端粒酶的结构与功能及其应用[J];湖南农业大学学报(自然科学版);2005年01期

4 解庭波;;大肠杆菌表达系统的研究进展[J];长江大学学报(自科版)医学卷;2008年03期

5 ;《RNA实验技术手册》(分子克隆实验指南系列)[J];科学通报;2004年17期

6 杜贻鹏;周俊宜;;人类端粒酶RNA组分的研究进展[J];热带医学杂志;2006年01期

7 屈艺,刘菽秋,彭文珍,刘柏林;人端粒酶逆转录酶核酶抑制端粒酶活性的实验研究[J];四川大学学报(自然科学版);2002年S1期

8 石健林,章为,周雪;核酶技术简介[J];四川解剖学杂志;2002年01期

9 童夏静;周金秋;;端粒和端粒酶的发现及其生物学意义[J];生命科学;2009年06期

10 刘卫辉;窦科峰;;SMART技术及其应用进展[J];中国生物工程杂志;2008年06期

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 李凌丹;犬贾第虫不同虫株及发育阶段的比较蛋白质组学研究[D];吉林大学;2012年

2 周丽娜;一种新的hTERT相互作用蛋白的筛选及鉴定[D];第三军医大学;2013年

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本文编号：407176