水稻T-DNA插入突变体库构建与利用及miRNA基因功能研究

发布时间：2017-06-02 18:09

  本文关键词：水稻T-DNA插入突变体库构建与利用及miRNA基因功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：水稻是重要的粮食作物又是禾本科的模式植物,研究水稻基因功能对水稻遗传改良和保障国家粮食安全均具有重大的意义。突变体是研究基因功能最直接有效的途径之一,但是自然突变因频率过低已不能满足科研的需求。人工高频地引入突变,并在基因组规模上构建突变体库将是解决这一矛盾的主要方法。T-DNA插入是目前最常用的突变体库构建方法,T-DNA既会破坏插入位点基因的功能,又可作为标签用于基因分离,还可通过在T-DNA上添加不同的报告基因元件来研究插入位点基因的表达模式。本研究参与创建了大型水稻T-DNA插入突变体库及小型mi RNA超表达突变体库,为研究植物功能基因组提供了公共技术平台。在大型T-DNA插入突变体库创建与利用研究中共获得以下3点结果:1.参与构建了5万株独立转化苗,目前本突变体库的植株数目已超过12万株。2.完成了3000个T1代家系的全生育期突变性状的观察记录,总体突变率为33.43%,并进一步完善了突变体库的表型数据资料。通过T-DNA插入与表型的初步共分离检测获得了一批有研究价值的材料,已从中获得3个严格共分离家系:CZH0773(03Z11BC50)、CZH1588(03Z11CA28)、CZH1731(03Z11CE42)。3.通过对3个共分离家系的遗传分析,本研究发现除T-DNA插入的破坏效应外,T-DNA上携带的35S启动子引起的基因增强与沉默亦是造成植株突变的原因之一。CZH0773家系的突变体表型为抽穗迟、半矮、叶色偏黄。T-DNA插入Os03g63050基因的3’末端。CZH1588家系突变体表现出抽穗迟、叶色偏黄的表型,但等位突变体及超表达和RNAi实验都没有出现突变表型。在短日条件下多个抽穗相关基因在突变体中的表达量显著下降,而超表达Hd3a基因使突变体提前抽穗,同时突变体对GA敏感,说明Hd3a和GA的下游路径在突变体中不受影响。CZH1731是一个矮化、分蘖多、抽穗迟的突变家系。虽然以上3个突变体的表型与T-DNA插入表现为严格的共分离,但是遗传互补实验发现互补载体与空载体均能使约一半的阳性转化苗恢复表型,表明T-DNA插入所破坏的基因并不是造成突变的原因。本研究结果阐明,突变表型是T-DNA上的35S启动子具有“增强子”效应造成插入位点附近基因表达量提高引起。而35S启动子甲基化测序结果则表明,互补载体转化后引起的表型恢复是由于互补载体上含有的35S启动子再次转入时引起35S启动子甲基化,进而抑制了35S启动子调控的基因表达。这一推断除了可以解释T-DNA插入对邻近基因的调控,还可以解释35S启动子对T-DNA上其它元件的调控。如T-DNA上携带的潮霉素基因和GUS报告基因均因为35S的驱动表现出高丰度的表达,但在突变体中再次引入含有35S启动子的载体后,潮霉素抗性和GUS报告基因表达均因为35S启动子的甲基化而被沉默。此外,较低比率的35S启动子能够逃逸甲基化修饰,仍表现出“增强子”功能,进而加深了突变体表型分析的复杂性。本研究揭示了T-DNA插入突变体中35S启动子引发的多重效应,对携带35S启动子的T-DNA插入突变体中的一些复杂现象给出了合理的解释,也加深了对突变体库的认识。本论文另一部分研究内容是小型水稻mi RNA超表达突变体库创建及基因功能研究。基于CZH1731家系突变体表型是mi R156e超量表达引起,为了系统研究水稻基因组中mi RNA的功能,本研究从62个mi RNA家族中成功克隆出53个基因,其中52个基因获得超表达转基因苗。主要研究工作有超量表达载体构建、遗传转化、表型鉴定分析及基因功能研究等。研究结果主要有以下2点:1.部分mi RNA基因超表达植株出现明显突变表型。mi R319超表达植株表现为愈伤分化率低至约5%、阳性率约50%、植株矮小、存活率低;mi R529超表达植株表现为分蘖多、半矮表型;超表达mi R167植株呈现出分蘖角度大、顶端优势缺失和穗顶端退化等表型;超表达mi R160植株也出现分蘖角度大表型;mi R399超表达植株表现为株型弱小、叶片末端出现磷中毒而枯黄,高磷胁迫发现转基因植株磷吸收效率比野生型高,同时mi R399靶基因的等位突变体也出现磷中毒表型。2.水稻mi R156的功能研究。CZH1731是从突变体库中筛选获得的一个矮化、分蘖多、抽穗迟和穗小的突变家系。研究表明突变表型是由于T-DNA插入造成附近mi R156e表达量提高引起。超表达osa-mi R156e和osa-mi R156e A都重现了突变体表型,且突变程度与基因表达量相关。czh1731M表现出明显的顶端优势缺失表型,并影响MAX/RMS/D路径基因的表达,推测可能存在一条通过mi R156调控水稻顶端优势和分蘖的新路径。通过GAL4-UAS系统和Os TB1启动子异位表达mi R156e能显著影响水稻株型。根据研究结果反向推断:适度降低mi R156e表达量将导致水稻分蘖数减少、穗大、单株产量提高,与理想株型相吻合,达到改良水稻株型的目的。
【关键词】：水稻 T-DNA 突变体库 35S启动子 甲基化 miRNA osa-miR156e 株型育种
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S511
【目录】：

• 缩写名词表8-9
• 中文摘要9-11
• Abstract11-14
• 1 文献综述14-38
• 1.1 植物突变体库与功能基因组学14-26
• 1.1.1 植物功能基因组学14-15
• 1.1.2 植物功能基因组学的研究方法及技术15-23
• 1.1.2.1 基于表达谱和高通量测序技术的基因功能研究15-16
• 1.1.2.2 基于突变体库的基因功能研究16-21
• 1.1.2.3 基于表达模式及表达量的基因功能研究21-23
• 1.1.3 T-DNA插入位点侧翼序列分离方法23-25
• 1.1.4 利用突变体库的两种研究策略25
• 1.1.5 T-DNA插入突变体库大小计算25-26
• 1.2 siRNA和miRNA26-35
• 1.2.1 siRNA26-30
• 1.2.1.1 siRNA的发现与加工过程26-27
• 1.2.1.2 siRNA的放大效应机制27-28
• 1.2.1.3 siRNA引起的转录后水平的基因沉默28
• 1.2.1.4 转录水平的基因沉默28
• 1.2.1.5 病毒诱导的基因沉默28-29
• 1.2.1.6 cis-acting siRNA和trans-acting siRNA29-30
• 1.2.2 miRNA30-35
• 1.2.2.1 miRNA发现与加工过程30-33
• 1.2.2.2 mi RNA-RISC对靶基因mRNA的抑制方式33
• 1.2.2.3 miRNA分离克隆与表达量的检测方法33
• 1.2.2.4 植物miRNA靶基因预测与鉴定33-34
• 1.2.2.5 人工构建miRNAs（Artificial miRNAs，amiRNAs)34
• 1.2.2.6 miRNA功能34-35
• 1.3 miR156与水稻株型35-38
• 2 本研究的目的和意义38-39
• 3 材料方法39-43
• 3.1 植物材料和生长条件39
• 3.2 突变体基因型判定与共分离检测39
• 3.3 mi RNA超表达载体构建39-40
• 3.4 Stem loop RT-PCR检测miRNA的表达量40
• 3.5 RT-PCR和qRT-PCR40-41
• 3.6 载体构建和遗传转化41
• 3.7 GAL4 UAS双元反式激活系统41-42
• 3.8 GUS与GFP表达检测42-43
• 4 结果与分析43-87
• 4.1 大型水稻T-DNA插入突变体库的构建43
• 4.2 突变体的种植、筛选与鉴定43-61
• 4.2.1 CZH0773（03Z11BC50）家系44-47
• 4.2.1.1 czh0773M突变体表型44-45
• 4.2.1.2 共分离检测45-46
• 4.2.1.3 czh0773M突变体互补试验46-47
• 4.2.2 CZH1731（03Z11CE42）家系47-48
• 4.2.3 CZH1588（03Z11CA28）家系48-61
• 4.2.3.1 czh1588M突变体的获得48-49
• 4.2.3.2 共分离检测49-50
• 4.2.3.3 其它相关实验50-54
• 4.2.3.4 互补实验出现转空载体恢复表型的现象54-55
• 4.2.3.5 35S启动子的增强与沉默效应造成突变表型的出现与消失55-58
• 4.2.3.6 35S启动子造成载体上的GUS报告基因异常表达58-60
• 4.2.3.7 发生甲基化的细胞内并非所有 35S启动子位点都被甲基化60-61
• 4.2.3.8 35S启动子甲基化测序61
• 4.3 小型miRNA超表达突变体库的构建61-62
• 4.4 部分miRNA超表达后的表型62-87
• 4.4.1 osa-miR319 超表达植株62
• 4.4.2 osa-miR529 超表达植株62-64
• 4.4.3 osa-miR167 超表达植株64-66
• 4.4.4 osa-miR160 超表达植株66-68
• 4.4.5 osa-miR399 超表达植株68-74
• 4.4.5.1 osa-miR399k-OX植株的获得68
• 4.4.5.2 T0 代osa-miR399k-OX植株出现磷中毒表型68-69
• 4.4.5.3 T1 代转基因植株磷吸收效率与转基因阳性检测共分离69-70
• 4.4.5.4 不同磷浓度胁迫处理，转基因植株磷吸收效率高70-72
• 4.4.5.5 miR399 靶基因的等位突变体表型72-74
• 4.4.6 czh1731 突变体（03Z11CE42）与水稻株型74-87
• 4.4.6.1 矮化丛生突变体的获得74-76
• 4.4.6.2 突变体表型是由于T-DNA插入造成osa-miR156e表达量提高引起76-78
• 4.4.6.3 超表达osa-miR156e和osa-miR156eA重现突变体表型78-79
• 4.4.6.4 miR156e-OX植株的突变程度与osa-miR156e的剂量相关79-81
• 4.4.6.5 超表达osa-miR156e影响MAX/RMS/D路径81-82
• 4.4.6.6 UAS-osa-miR156e异位表达系统改造水稻株型82-85
• 4.4.6.7 pTB1:miR156e改良水稻株型85-87
• 5 讨论87-93
• 5.1 水稻突变体库概况87
• 5.2 35S启动子甲基化的发现与利用87-89
• 5.3 T-DNA在插入突变体中的激活标签功能89
• 5.4 miR156 可能通过MAX/RMS/D路径影响水稻顶端优势和分蘖89-90
• 5.5 miR156 可能与物种进化有关90-91
• 5.6 miR156 可作为改良水稻株型的潜在工具91-92
• 5.7 GAL4 UAS双元反式激活系统在杂交后代中不稳定92
• 5.8 本研究后续工作的展望92-93
• 参考文献：93-107
• 附录1 引物序列107-113
• 附录2 国际水稻研究所水培营养配方113-114
• 附录3 部分实验的详细步骤及试剂配方114-128
• 附录4 作者简历128-129
• 致谢129-130

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 Yuxiao Chang;Tuan Long;Changyin Wu;;Effort and Contribution of T-DNA Insertion Mutant Library for Rice Functional Genomics Research in China:Review and Perspective[J];Journal of Integrative Plant Biology;2012年12期

  本文关键词：水稻T-DNA插入突变体库构建与利用及miRNA基因功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：416102