ANR1在水稻中的同源基因OsMADS25、OsMADS27和OsMADS57的克隆和功能分析

发布时间：2017-06-03 14:23

  本文关键词：ANR1在水稻中的同源基因OsMADS25、OsMADS27和OsMADS57的克隆和功能分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：MADS-box家族转录因子对植物生长和发育调控起着重要调控作用,但是其中大部分基因功能至今仍不清楚。ANR1是已被鉴定的可通过硝酸盐信号途径调控拟南芥侧根发育的关键功能基因。生物信息学的分析结果显示ANR1在水稻中有5个同源基因：OsMADS23,OsMADS25, OsMADS27, OsMADS57和OsMADS61,它们都属于拟南芥AGL17基因家族。本研究用荧光定量PCR检测了野生型材料日本晴中这5个基因对营养元素氮(N)、磷(P)、硫(S)和激素的响应方式。我们的研究结果显示这5个MADS-box家族基因对N、P、S的响应机制各不相同。本研究选择了其中3个受N03-诱导的基因(OsMADS25, OsMADS27和OsMADS57)进行克隆,利用分子生物学技术对它们调控根系生长的分子机制进行研究。取得的主要研究结果如下：1.本研究首先检测了野生型材料日本晴中,OsMADS25对N、P、S和激素的响应方式。OsMADS25基因表达受N03诱导,受NH4+抑制；受S饥饿诱导,重新供给S时表达量显著下降；受P饥饿抑制；受NAA诱导,不受6-BA影响。本研究还发现OsMADS25蛋白主要在细胞核中表达。在拟南芥中过量表达OsMADS25能显著促进拟南芥主根生长和增加侧根数量,在有N03-存在时,过量表达OsMADS25能显著增加拟南芥侧根密度和长度。除此之外,OsMADS25也能显著促进拟南芥地上部分的生长,这种促进作用在N03-出现时更加强烈。这些研究结果证明OsMADS25能调控拟南芥根系(主根长度、侧根数量、侧根密度和侧根长度)和地上部分的生长。在水稻中的研究结果显示,在N03-存在时,过量表达OsMADS25显著促进水稻主根和侧根生长,同时侧根数量和侧根密度显著增加,而OsMADS25 RNAi干扰株系则表现出了完全相反的表型,这个研究结果表明OsMADS25是通过参与N03-信号途径调控水稻根系生长的重要因子。供给10mM KNO3时,与野生型相比,OsMADS25过量表达株系初生根长度和地上部分长度显著增加,硝态氮含量显著升高,硝酸盐转运蛋白基因表达也显著升高,但OsMADS25 RNAi干扰株系地上部分和初生根长度显著降低,硝态氮含量显著降低,硝酸盐转运蛋白基因表达量显著下降。对生长4周的转基因材料进行测定,野生型和转基因材料中氮素和磷素总含量没有明显差异,但是OsMADS25 RNAi干扰株系中地上部分的N03-含量和S042-含量显著降低,根系的N03-含量、S042-含量以及P043-含量显著降低。本研究初步结果还显示OsMADS25参与调控拟南芥和水稻的抗盐胁迫过程。2.本研究检测了日本晴中OsMADS27对3种营养元素和激素的响应方式。研究结果发现OsMADS27基因表达受N03诱导,受NH4+抑制,不受谷氨酸盐的影响；受S饥饿诱导,重新供给S时表达量下降；受P饥饿抑制；受NAA诱导,不受6-BA影响。本研究发现OsMADS27蛋白主要定位在细胞核中。在拟南芥中,过量表达OsMADS27能显著促进拟南芥的主根生长和增加侧根数量,但是对侧根长度无显著影响。对4周大小的转基因水稻材料进行测定,发现野生型和转基因材料中氮素和磷素总含量没有显著差异,但是OsMADS27干扰株系根系中N03-含量、SO42-含量以及P043-含量与野生型相比显著降低。3.本研究同时也检测了日本晴中OsMADS57对N、P、S和激素的响应方式。研究发现OsMADS57基因表达受N03-诱导,受N饥饿抑制,不受其他氮源的影响；受S饥饿诱导,重新供给S时表达量下降；受NAA诱导,不受6-BA影响。本研究发现OsMADS57蛋白主要在细胞核中表达。对拟南芥野生型Col-0和OsMADS57过量表达株系进行不同浓度的N03-处理,研究发现只有在供给0.2mM KNO3时,OsMADS57过量表达能够显著促进主根生长和增加侧根数量,无KN03时侧根长度无显著差异,但是供给KN03时侧根长度显著增加。综上所述,本研究发现证明了OsMADS25是通过硝酸盐信号途径调控拟南芥和水稻根系和地上部分生长的重要因子。OsMADS27和OsMADS57也是通过硝酸盐途径影响拟南芥根系生长的重要功能基因。以上研究结果为研究水稻根系生长,提高水稻氮素利用效率提供了有力的理论依据,并为通过遗传学和生物学技术途径培育氮素高利用率的品种提供重要的基因资源。
【关键词】：拟南芥 水稻 ANR1 MADS-box 硝酸盐 侧根 根系
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S511
【目录】：

• 致谢7-8
• 中文摘要8-10
• Abstract10-18
• 第一章 文献综述18-42
• 1 水稻氮素营养意义18-20
• 1.1 氮素对水稻生产的重要意义18-19
• 1.2 如何有效的施用氮肥19-20
• 2 拟南芥和水稻对外界N03-的适应性研究进展20-30
• 2.1 硝酸盐转运体系20
• 2.2 硝酸盐转运蛋白家族20-27
• 2.3 硝酸盐的信号识别作用27-30
• 3 侧根的生长发育过程30-38
• 3.1 水稻根系构成30-31
• 3.2 侧根的发育过程31-32
• 3.3 拟南芥根系对外界NO_3~-的适应性研究进展32-36
• 3.4 水稻中关于侧根研究的最新进展36-38
• 4 MADS-box研究进展38-40
• 4.1 MADS-box基因的研究38-39
• 4.2 ANR1基因的研究39-40
• 5 本研究的目的和意义40-42
• 第二章 OsMADS25通过NO_3~-信号途径调控水稻生长的功能研究42-96
• 1 材料与方法42-70
• 1.1 植物材料和生长条件42
• 1.2 OsMADS25基因表达对N、P、S及激素的响应42-44
• 1.3 基因克隆和载体构建44-55
• 1.4 水稻遗传转化与株系筛选55-61
• 1.5 拟南芥转化及株系筛选61-62
• 1.6 荧光定量PCR62
• 1.7 OsMADS25对拟南芥根系生长的影响62-63
• 1.8 不同浓度NO_3~-条件下OsMADS25对水稻生长的影响63-66
• 1.9 OsMADS25蛋白的亚细胞定位66
• 1.10 生长素途径响应基因的qRT-PCR分析66-67
• 1.11 盐胁迫处理转基因植株67-69
• 1.12 NO_3~-、SO_4~(2-)和PO_4~(3-)含量的测定69-70
• 1.13 N总含量和P总含量的测定70
• 1.14 统计分析方法70
• 2 结果与分析70-93
• 2.1 OsMADS25基因表达对营养元素(N、P、S)和激素的响应方式70-74
• 2.2 OsMADS25蛋白的亚细胞定位74-75
• 2.3 转基因材料的qRT-PCR鉴定75-77
• 2.4 OsMADS25对拟南芥生长的影响77-80
• 2.5 OsMADS25通过NO_3~-信号途径调控水稻生长80-86
• 2.6 OsMADS25对盐胁迫的响应86-91
• 2.7 生长素途径响应基因的qRT-PCR分析91
• 2.8 OsMADS25基因过量表达及干扰对水稻N素和P素积累的影响91-92
• 2.9 OsMADS25基因过量表达及干扰对NO_3~-、SO_4~(2-)和PO_4~(3-)含量的影响92-93
• 3 讨论93-96
• 第三章 OsMADS27的克隆和功能分析96-110
• 1 材料与方法96-99
• 1.1 植物材料和生长条件96
• 1.2 OsMADS27基因表达对N、P、S及激素的响应96
• 1.3 基因克隆和载体构建96-97
• 1.4 水稻遗传转化与株系筛选97
• 1.5 拟南芥转化及株系筛选97
• 1.6 RNA提取及荧光定量PCR97
• 1.7 OsMADS27对拟南芥根系生长的影响97
• 1.8 OsMADS27蛋白的亚细胞定位97
• 1.9 生长素途径响应基因的qRT-PCR分析97-98
• 1.10 盐胁迫处理转基因植株98
• 1.11 NO_3~-、SO_4~(2-)和PO_4~(3-)含量的测定98-99
• 1.12 N总含量和P总含量的测定99
• 1.13 统计分析方法99
• 2 结果与分析99-107
• 2.1 OsMADS27基因表达对营养元素(N、P、S)和激素的响应方式99-101
• 2.2 OsMADS27蛋白的亚细胞定位101
• 2.3 转基因株系的qRT-PCR鉴定101-103
• 2.4 OsMADS27在拟南芥中的功能验证103-105
• 2.5 盐胁迫条件下OsMADS27对拟南芥幼苗生长的影响105
• 2.6 OsMADS27基因过量表达及干扰对水稻氮素和磷素积累的影响105-106
• 2.7 OsMADS27转基因植株中NO_3~-、SO_4~(2-)和PO_4~(3-)含量的分析106-107
• 2.8 生长素途径响应基因的qRT-PCR分析107
• 3 讨论107-110
• 第四章 OsMADS57的克隆和功能分析110-119
• 1 材料与方法110-112
• 1.1 植物材料和生长条件110
• 1.2 OsMADS57基因表达对N、P、S及激素的响应110
• 1.3 基因克隆和载体构建110-111
• 1.4 水稻遗传转化与株系筛选111
• 1.5 拟南芥转化及株系筛选111
• 1.6 RNA提取及荧光定量PCR111
• 1.7 OsMADS57对拟南芥根系生长的影响111-112
• 1.8 OsMADS57蛋白的亚细胞定位112
• 1.9 盐胁迫处理转基因植株112
• 2 结果与分析112-117
• 2.1 OsMADS57基因表达对N、P、S及激素的响应112-113
• 2.2 OsMADS57蛋白的亚细胞定位113-114
• 2.3 转基因材料的qRT-PCR鉴定114-115
• 2.4 OsMADS57在拟南芥中的功能验证115-117
• 2.5 盐胁迫条件下OsMADS57对拟南芥幼苗生长的影响117
• 3 讨论117-119
• 第五章 OsMADS23和OsMADS61对N、P、S的响应119-127
• 1 材料与方法119
• 1.1 植物材料和生长条件119
• 1.2 OsMADS23和OsMADS61基因表达对N、P、S及激素的响应119
• 1.3 RNA提取及荧光定量PCR119
• 2 结果与分析119-125
• 2.1 OsMADS23和OsMADS61基因表达对N、P、S及激素的响应119-122
• 2.2 OsNRT2；1、OsNAR2.1、OsIPS1及OsSULTR1；1对N饥饿和重新供给NO_3~-的响应122-123
• 2.3 OsNRT2;1、OsNAR2.1、OsIPSl及OsSULTR1；1对P饥饿和重新供给PO_4~(3-)的响应123-124
• 2.4 OsNRT2;1、OsNAR2.1、OsIPS1和OsSULTR1；1对S饥饿和重新供给SO_4~(2-)的响应124-125
• 3 讨论125-127
• 第六章 全文总结与展望127-130
• 1 全文总结127-128
• 2 展望128-130
• 参考文献130-145
• 攻读博士学位期间的研究成果145
• 作者简历145

【参考文献】

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本文编号：418415