新型丁酸梭菌筛选及其对断奶仔猪生长性能和肠道功能影响的研究

发布时间：2017-06-06 12:20

  本文关键词：新型丁酸梭菌筛选及其对断奶仔猪生长性能和肠道功能影响的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：针对畜禽养殖生产中抗生素和氧化锌的长时、超量使用可能导致耐药菌株的产生、食品安全隐患和生态环境污染等一系列问题,本研究从有效保护和改善断奶仔猪肠道屏障功能和免疫功能的角度出发,以分泌抗菌肽为目标,从仔猪肠道内容物中筛选、鉴定得到发酵上清液具有较强抑菌活性的丁酸梭菌ZJU-F1,首先研究了其体外生物学活性、体内定植特性和安全性；然后对其发酵液中抗菌肽CBP22进行分离、鉴定,并探讨了抗菌肽CBP22对LPS诱导小鼠肠炎的保护作用；在此基础上,研究了丁酸梭菌ZJU-F1在日粮中替代抗生素并降低氧化锌剂量对断奶仔猪生长性能、消化功能、肠道屏障功能的影响；最后通过体内和体外试验研究丁酸梭菌ZJU-F1对仔猪免疫功能的影响及其可能机制。主要研究结果如下：试验一、新型丁酸梭菌筛选丁酸梭菌筛选、鉴定和体外生物学活性：采用厌氧培养法进行菌种分离,孔穴琼脂扩散法进行抑菌活性筛选,从仔猪盲肠内容物中分离到6株丁酸梭菌,其中3株菌种发酵上清液对E. coli K88、S. aureus ATCC 25923均具有明显抑制作用,并确定其抑菌物质是蛋白质或多肽,选取发酵上清液抑菌活性最强的丁酸梭菌ZJU-F1为目标菌株。进一步研究表明丁酸梭菌ZJU-F1具有较快的生长速度,耐温、耐酸、耐胆盐,且对多种抗生素耐受,该菌种保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。丁酸梭菌产酶、产酸、产维生素特性：比较了6株不同来源的丁酸梭菌产酸、产酶和产维生素能力。丁酸梭菌ZJU-1分泌淀粉酶和蛋白酶活性分别达2515.43 U/mL和93.72U/mL,显著高于丁酸梭菌CGMCC1.209 (p0.05);乙酸和丁酸的分泌量分别达2.29g/L和1.67g/L,显著高于丁酸梭菌CGMCC1.335(p0.05);维生素B3的产量达175.95 μg/L,显著高于丁酸梭菌S1、丁酸梭菌CGMCC1.209、丁酸梭菌CGMCC 1.335和丁酸梭菌CGMCC1.336 (p0.05)。结果表明丁酸梭菌ZJU-F1具有较强的产酶、产酸和产维生素的特性。丁酸梭菌ZJU-F1的体内定植特性：灌胃2×108 CFU经抗生素抗性筛选的丁酸梭菌ZJU-F1考察其在小鼠肠道内的分布和定植情况。结果表明,灌胃后1 d,小鼠各肠段中丁酸梭菌ZJU-F1的粘附数量最高,其后数量逐渐降低,灌胃后第7d数量低于103CFU,其主要粘附部位为回肠、盲肠和结肠黏膜,结果表明丁酸梭菌ZJU-F1能在动物体内定植,主要定植部位为后肠。丁酸梭菌ZJU-F1的安全性评价：采用小鼠急性经口毒性试验评价该菌株的安全性。结果表明,小鼠对丁酸梭菌菌悬液(1.2×109CFU/g)经口毒性试验最大耐受量大于20.0g/Kg体重,依据GB 15193.3-2014判定为实际无毒,表明丁酸梭菌ZJU-F1可作为一种潜在的安全饲料添加剂。试验二、丁酸梭菌抗菌肽的分离、鉴定及其对LPS肠炎小鼠的保护作用研究抗菌肽分离、鉴定：经硫酸铵沉淀、亲和层析、阳离子交换和反向高效液相色谱的方法分离纯化丁酸梭菌ZJU-F1分泌的抗菌肽CBP22,是由22个氨基酸组成的线性肽,分子量是2264.6 Da,等电点8.64,该抗菌肽对E. coli K88、 S.aureus ATCC 25923的最小抑菌浓度分别为32μg/mL、64μg/mL。CBP22对LPS诱导小鼠肠炎保护的作用研究：在抗菌肽CBP22抑菌活性研究的基础上,开展了其对LPS诱导的肠炎小鼠肠道屏障功能和免疫功能的影响。肠道屏障功能研究结果：肠道通透性方面,CBP22预处理组能显著缓解LPS引起的小鼠的肠道通透性增加(p0.05),达到正常对照组水平；肠道形态结构和细胞凋亡方面,CBP22预处理组小鼠在LPS处理后,空肠绒毛高度高于LPS处理组,其中8mg/Kg CBP22预处理组绒毛高度提高了27.60% (P＜0.05); 4mg/Kg和8 mg/Kg CBP22组凋亡指数分别较LPS组下降82.65%(p0.05)和86.81%(p0.05),达到正常对照组水平。紧密连接蛋白基因表达方面,腹腔注射CBP22可以显著缓解因LPS引起的空肠ZO-1和ZO-2基因表达的下调(p0.05)。结果提示腹腔注射CBP22可缓解LPS引起的空肠绒毛损伤和肠上皮细胞凋亡、脱落,维持肠道屏障功能。免疫功能研究结果：血清免疫球蛋白和炎症因子方面,CBP22预处理能显著降低LPS引起的小鼠血清IgG、IgA、 IgM和TNF-a的升高(p0.05),达到正常对照组水平。回肠sIgA和TNF-a基因表达方面,4 mg/Kg和8mg/Kg CBP22预处理能显著缓解LPS刺激引起的小鼠回肠sIgA和TNF-a基因表达量升高(p0.05),达到正常对照组水平。结果提示,CBP22显著缓解LPS引起的小鼠血清IgG、IgA、IgM和TNF-a的升高,并降低回肠sIgA水平和TNF-a基因表达。试验三、丁酸梭菌ZJU-F1对断奶仔猪生长性能、消化功能和屏障功能的影响在丁酸梭菌ZJU-F1的体外生物学活性、安全性及其抗菌肽对小鼠肠炎保护作用的研究基础上,选取150头23±2日龄“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪,随机分为5组：2250mg/Kg Zn+抗生素组(基础日粮-2250 mg/Kg锌+抗生素)、+1125 mg/Kg Zn+抗生素组(基础日粮+1125 mg/Kg锌+抗生素)、地衣芽孢杆菌组(基础日粮+1125 mg/Kg锌+109CFU/Kg地衣芽孢杆菌)、丁酸梭菌组(基础日粮+1125 mg/Kg锌+108 CFU/Kg丁酸梭菌ZJU-F1)、复合菌组(基础日粮+1125mg/Kg锌+109 CFU/Kg地衣芽孢杆菌+108 CFU/Kg丁酸梭菌ZJU-F1),锌均为氧化锌形式添加,试验期14天,从生长性能、消化功能、肠道屏障功能等角度探讨丁酸梭菌ZJU-F1替代抗生素并降低氧化锌剂量的可行性。生长性能和腹泻率结果表明：与1125 mg/Kg Zn+抗生素组相比,丁酸梭菌组和复合菌组均能显著提高断奶仔猪平均日增重(ADG)、显著降低料重比(FCR)和腹泻率(p0.05),达到与2250 mg/Kg Zn+抗生素组同等效果。结果提示,丁酸梭菌ZJU-F1及其复合菌制剂可以较好地替代抗生素并降低氧化锌的使用剂量。消化功能结果表明：消化酶活性方面,与1125 mg/Kg Zn+抗生素组相比,丁酸梭菌组和复合菌组能显著提高十二指肠淀粉酶、空肠淀粉酶和脂肪酶活性(p0.05),达到2250mg/Kg Zn+抗生素组水平。表观消化率方面,丁酸梭菌组和复合菌组显著提高于物质、粗蛋白、钙和磷的表观消化率(p0.05),达到2250 mg/Kg Zn+抗生素组水平。结果提示,丁酸梭菌ZJU-F1及其复合菌可能通过分泌消化酶来辅助消化,提高饲料营养物质的表观消化率。肠道屏障功能结果：肠道通透性方面,与1125 mg/Kg Zn+抗生素组相比,丁酸梭菌组和复合菌组显著降低血清中的D-乳酸含量和二胺氧化酶活性(p0.∞),达到甚至优于2250 mg/Kg Zn+抗生素组水平。肠道形态方面,与1125 mg/Kg Zn+抗生素组相比,丁酸梭菌组和复合菌组能显著提高十二指肠、空肠、回肠的绒毛高度和绒/隐比值(p0.05),达到2250 mg/Kg Zn+抗生素组水平,其中复合菌组绒/隐比显著高于2250 mg/Kg Zn+抗生素组(p0.05)。十二指肠TEM结果显示,丁酸梭菌组和复合菌组微绒毛长且致密。结果提示丁酸梭菌ZJU-F1及其复合菌能缓解因断奶引起的肠道通透性增加,并能明显改善断奶仔猪肠道形态,促进营养素的吸收,进而提高生长性能。体内紧密连接蛋白表达方面,在十二指肠组织中,丁酸梭菌组和复合菌组的紧密连接蛋白ZO-2. Claudin-1、Occludin基因表达量显著高于1125 mg/Kg Zn+抗生素组(pn05),复合菌组ZO-2、Occludin基因表达显著高于2250 mg/Kg Zn+抗生素组(p0.05)。在空肠组织中,与2250 mg/Kg Zn+抗生素组比较,丁酸梭菌组和复合菌组的ZO-1、ZO-2基因和ZO-1、Occludin蛋白表达量显著上调(p0.05)；在回肠组织中,丁酸梭菌组和复合菌组较1125 mg/Kg Zn+抗生素组ZO-1、ZO-2、Claudin-1、Occludin基因和ZO-1、Claudin-1、 Occludin蛋白表达显著上调(p0.05)。体外细胞试验进一步揭示,丁酸梭菌ZJU-F1能提高IPEC-J2细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin的基因和蛋白表达量,其中Occludin mRNA和蛋白的表达量显著提高(p0.05)。结果提示,丁酸梭菌ZJU-F1可以促进肠道紧密连接蛋白基因和蛋白的表达,增强猪肠道的分子屏障功能。体内小肠黏蛋白基因表达方面,与1125 mg/Kg Zn+抗生素组比较,丁酸梭菌组和复合菌组显著上调了十二指肠、空肠和回肠的MUC1、MUC4、MUC20基因表达(p0.05)；与2250 mg/Kg Zn+抗生素组相比,丁酸梭菌组和复合菌组显著上调了十二指肠MUC1、 MUC4,空肠MUC1、 MUC4、MUC20和回肠MUC1、 MUC4基因表达(p0.05)。结果提示,丁酸梭菌ZJU-F1及其复合菌制剂可以促进小肠上皮黏蛋白的分泌,增强猪肠道化学屏障功能。肠道微生物区系方面,丁酸梭菌组和复合菌组能提高盲肠内容物中厚壁菌门细菌比例,并降低拟杆菌门的比例。地衣芽孢杆菌组、丁酸梭菌组和复合菌组乳酸菌属的比例均高于2250 mg/Kg Zn+抗生素组和1125 mg/Kg Zn+抗生素组,其中复合菌组差异显著(p0.05)。肠道短链脂肪酸方面,与1125 mg/Kg Zn+抗生素组比较,地衣芽孢杆菌组盲肠内容物的丁酸含量显著提高p0.05),丁酸梭菌组和复合菌组显著提高乙酸、丙酸、丁酸含量(p0.05)；与2250 mg/Kg Zn+抗生素组相比,复合菌组丁酸含量显著提高(p0.05)。结果提示,饲料日粮中添加丁酸梭菌ZJU-F1和复合菌可以改善肠道菌群、促进肠道菌群结构优化,并提高SCFA含量,进而增强仔猪肠道微生物屏障功能。试验四、丁酸梭菌ZJU-F1对猪免疫功能的影响及机制研究在研究了丁酸梭菌ZJU-F1及其复合菌制剂对断奶仔猪生长性能、消化功能和肠道屏障功能有改善作用的基础上,进一步通过体内和体外试验研究了丁酸梭菌ZJU-F1对免疫功能的影响及可能机制。丁酸梭苗ZJU-F1对断奶仔猪免疫功能影响：体内体液免疫功能结果表明,与1125mg/Kg Zn+抗生素组相比,丁酸梭菌组和复合菌组提高血清中IgA的含量和补体C3、C4水平(p0.05)；细胞因子方面,与1125 mg/Kg Zn+抗生素组相比,丁酸梭菌组和复合菌组显著降低促炎因子IL-6、TNF-α、 IFN-γ含量(p0.05)。抗菌肽表达结果显示,与1125mg/Kg Zn+抗生素组相比,丁酸梭菌组和复合菌组显著提高了骨髓中PR-39、 PG1-5和PMAP23、肝脏中Hepecidin和PR-39、胸腺中PR-39、肠系膜淋巴结中PR-39和PG1-5、回肠中pBDs和PR-39的基因表达(p0.05),并显著高于2250 mg/Kg Zn+抗生素组(p0.05)。结果表明,丁酸梭菌ZJU-F1及其复合菌制剂可以通过提高血清中免疫球蛋白水平、降低促炎因子表达,并提高抗先天免疫因子抗菌肽的表达来提高断奶仔猪免疫性能和抗病力,这可能与丁酸梭菌分泌的丁酸和抗菌肽有关。肠黏膜炎症细胞因子方面,丁酸梭菌组、复合菌组回肠TNF-α、IL-6、 IL-8基因表达上调,显著高于2250 mg/Kg Zn+抗生素组(p0.05); sIgA方面,日粮中分别添加丁酸梭菌ZJU-F1及复合菌显著提高回肠sIgA含量(p0.05),达到2250 mg/Kg Zn+抗生素组水平。提示丁酸梭菌ZJU-F1及其复合菌制剂通过提高回肠促炎因子表达和sIgA水平来改善肠道黏膜免疫功能。丁酸梭菌ZJU-F1对IPEC-J2细胞粘附作用：丁酸梭菌ZJU-F1对IPEC-J2细胞的粘附率为8.38%,显著低于致病菌大肠杆菌K88的粘附率(p0.05)；粘附后上皮细胞LDH释放率为1.23%,显著低于大肠杆菌K88处理组(p0.05)；当丁酸梭菌和大肠杆菌K88共同孵育IPEC-J2细胞时,丁酸梭菌ZJU-F1能显著抑制大肠杆菌K88对IPEC-J2的粘附作用(p0.05)；排斥和驱除试验表明,丁酸梭菌ZJU-F1能使大肠杆菌K88的粘附率分别降低至3.87%和7.05%。结果提示丁酸梭菌ZJU-F1能在肠道上皮细胞粘附并抑制致病菌的粘附,促进肠道健康。体外细胞试验揭示丁酸梭菌ZJU-F1能够刺激IPEC-J2细胞TLR-2基因的表达,进而活化NF-κB,诱导骨髓样分化因子MyD88的表达；丁酸梭菌ZJU-F1显著提高猪肠道上皮细胞IPEC-J2促炎因子TNF-α、IL-1β以及趋化因子IL-8、抑炎因子IL-4、IL-10的基因表达(p0.05)。提示丁酸梭菌ZJU-F1可能是通过激活TLR-2介导的MyD88信号通路途径,引起肠上皮细胞促炎因子和抑炎因子的表达来增加肠道黏膜免疫功能。综上所述,本研究以分泌具有高效抗菌活性和肠道屏障保护功能的抗菌肽为目标筛选得到产CBP22的丁酸梭菌ZJU-F1,并从生长性能、肠道屏障功能和免疫调节功能等方面揭示了新型丁酸梭菌ZJU-F1主要是利用菌体本身及其分泌的抗菌肽和丁酸保护断奶仔猪肠道功能,改善仔猪因断奶引起的肠道损伤和机体炎症,提高机体免疫能力,提示新型丁酸梭菌ZJU-F1能够替代断奶仔猪日粮中抗生素并降低氧化锌的使用剂量,具有广泛的应用前景。
【关键词】：丁酸梭菌 抗菌肽 断奶仔猪 屏障功能 免疫功能 抗生素 氧化锌
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S828
【目录】：

• 致谢12-13
• 摘要13-18
• ABSTRACT18-26
• 缩略词表26-28
• 第一章 文献综述28-48
• 1 ‘营养替抗’研究进展28-31
• 1.1 抗生素和氧化锌的应用现状及危害28-29
• 1.2 ‘营养替抗’策略29-31
• 2 肠道微生物的研究进展31-35
• 2.1 正常微生态菌群的组成32
• 2.2 常肠道微生物菌群的生理作用32-35
• 3 益生菌的研究进展35-42
• 3.1 益生菌概述35-36
• 3.2 益生菌的筛选标准36-37
• 3.3 益生菌的种类37-41
• 3.4 益生菌的作用机理41-42
• 3.5 益生菌的研究方向42
• 4 丁酸梭菌研究进展42-45
• 4.1 丁酸梭菌的概述42-43
• 4.2 丁酸梭菌的生理功能43-44
• 4.3 丁酸梭菌在动物生产中应用现状44-45
• 5 本研究的目的意义与研究内容45-48
• 5.1 本研究的目的意义45-46
• 5.2 主要研究内容46-48
• 第二章 新型丁酸梭菌筛选48-71
• 1 新型丁酸梭菌筛选、鉴定48-57
• 1.1 试验材料48-49
• 1.2 试验方法49-51
• 1.3 结果与分析51-56
• 1.4 讨论56-57
• 2 丁酸梭菌ZJU-F1体外生物学特性研究57-65
• 2.1 试验材料57-58
• 2.2 试验方法58-59
• 2.3 结果分析59-64
• 2.4 讨论64-65
• 3 丁酸梭菌的ZJU-F1肠道粘附特性研究65-69
• 3.1 试验材料65-66
• 3.2 试验方法66-67
• 3.3 试验结果67-68
• 3.4 讨论68-69
• 4 丁酸梭菌ZJU-F1的小鼠急性经口毒性试验69-71
• 4.1 试验材料69
• 4.2 实验方法69-70
• 4.3 结果分析70
• 4.4 讨论70-71
• 第三章 丁酸梭菌ZJU-F1分泌的抗菌肽的分离、鉴定及其对LPS诱导小鼠肠炎的保护作用研究71-89
• 1 丁酸梭菌抗菌肽的分离、鉴定71-77
• 1.1 试验材料71-72
• 1.2 试验方法72-74
• 1.3 结果分析74-76
• 1.4 讨论76-77
• 2 抗菌肽CBP22对LPS诱导小鼠肠炎的保护作用研究77-89
• 2.1 试验材料77
• 2.2 试验方法77-81
• 2.3 结果分析81-87
• 2.3.1 CBP22对LPS肠炎小鼠肠道屏障功能的影响81-85
• 2.3.2 CBP22对LPS肠炎小鼠免疫功能的影响85-87
• 2.4 讨论87-89
• 第四章 丁酸梭菌ZJU-F1对断奶仔猪生长性能、消化功能和肠道屏障功能的影响89-125
• 1 丁酸梭菌ZJU-F1对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响89-94
• 1.1 试验材料89-91
• 1.2 试验方法91-92
• 1.3 结果分析92-93
• 1.3.1 丁酸梭菌ZJU-F1对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响92-93
• 1.4 讨论93-94
• 2 丁酸梭菌ZJU-F1对断奶仔猪消化功能的影响94-98
• 2.1 试验材料94
• 2.2 试验方法94-95
• 2.3 结果分析95-97
• 2.3.1 丁酸梭菌ZJU-F1对断奶仔猪消化酶活性的影响95-96
• 2.3.2 丁酸梭菌ZJU-F1对断奶仔猪表观消化率的影响96-97
• 2.4 讨论97-98
• 3. 丁酸梭菌ZJU-F1对断奶仔猪肠道屏障功能的影响98-114
• 3.1 试验材料98-99
• 3.2 试验方法99-103
• 3.3 结果分析103-112
• 3.3.1 丁酸梭菌ZJU-F1对断奶仔猪血清中D-乳酸、二胺氧化酶的影响103-104
• 3.3.2 丁酸梭菌ZJU-F1对断奶仔猪小肠形态的影响104-106
• 3.3.3 丁酸梭菌ZJU-F1对断奶仔猪小肠紧密连接基因和蛋白表达的影响106-109
• 3.3.4 丁酸梭菌ZJU-F1对IPEC-J2细胞紧密连接基因和蛋白表达的影响109-110
• 3.3.5 丁酸梭菌ZJU-F1对断奶仔猪小肠黏蛋白基因表达的影响110-112
• 3.4 讨论112-114
• 4 丁酸梭菌ZJU-F1对断奶仔猪肠道微生物多样性和短链脂肪酸的影响114-125
• 4.1 试验材料114-115
• 4.2 试验方法115-116
• 4.3 结果分析116-123
• 4.3.1 益生菌对盲肠微生物多样性的影响116-123
• 4.3.2 丁酸梭菌ZJU-F1对盲肠短链脂肪酸的影响123
• 4.4 讨论123-125
• 第五章 丁酸梭菌ZJU-F1对断奶仔猪免疫功能的影响及机制研究125-148
• 1 丁酸梭菌ZJU-F1对断奶仔猪免疫功能的影响125-136
• 1.1 试验材料125-126
• 1.2 试验方法126-128
• 1.3 结果分析128-132
• 1.3.1 丁酸梭菌ZJU-F1对断奶仔猪血清免疫球蛋白、补体和细胞因子的影响128-129
• 1.3.2 丁酸梭菌ZJU-F1对断奶仔猪免疫器官抗菌肽基因表达129-131
• 1.3.3 丁酸梭菌ZJU-F1对断奶仔猪回肠黏膜免疫的影响131-132
• 1.4 讨论132-136
• 2 丁酸梭菌ZJU-F1对肠道上皮细胞IPEC-J2粘附作用136-142
• 2.1 试验材料136
• 2.2 试验方法136-139
• 2.3 结果分析139-141
• 2.3.1 丁酸梭菌ZJU-F1对IPEC-J2的粘附率139-140
• 2.3.2 丁酸梭菌ZJU-F1粘附对IPEC-J2细胞损伤的影响140
• 2.3.3 丁酸梭菌ZJU-F1对大肠杆菌k88粘附竞争、排斥、驱除作用140-141
• 2.4 讨论141-142
• 3 丁酸梭菌ZJU-F1对肠道上皮细胞IPEC-J2免疫调节作用及机制研究142-148
• 3.1 试验材料142-143
• 3.2 试验方法143-144
• 3.3 结果分析144-146
• 3.3.1 丁酸梭菌ZJU-F1对IPEC-J2细胞TLR-2表达水平的影响144
• 3.3.2 丁酸梭菌ZJU-F1对IPEC-J2细胞MyD88/NF-κB表达水平的影响144-145
• 3.3.3 丁酸梭菌ZJU-F1对IPEC-J2细胞细胞因子表达的影响145-146
• 3.4 讨论146-148
• 第六章 结论、创新点和研究展望148-150
• 1 结论148
• 2 创新点148-149
• 3 研究展望149-150
• 参考文献150-174
• 作者简历及在学期间取得的科研成果174

【参考文献】

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本文编号：426373