中国甘薯双生病毒种类鉴定、分子变异及检测方法研究

发布时间：2017-06-06 22:07

  本文关键词：中国甘薯双生病毒种类鉴定、分子变异及检测方法研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：甘薯是我国重要的粮食作物、食品加工和工业原料及有潜力的能源作物。我国是世界上最大的甘薯生产国。近年来甘薯双生病毒病在我国的发生危害日益加重,严重影响甘薯产业的健康发展。由于我国甘薯双生病毒病一直缺乏系统研究,甘薯双生病毒的种类、分布、分子变异及致病性尚不清楚,导致对这一病害的防控缺乏科学依据。针对上述问题开展了相关研究,取得主要结果如下： 1)中国甘暮双生病毒的种类、发生频率及分布：利用PCR和RCA方法对采自全国20多个省(市)的约330份甘薯样品进行了双生病毒的检测。共获得51个甘薯双生病毒基因组(近)全长序列。我国甘薯双生病毒有9个种,包括甘薯曲叶病毒(Sweet potato leaf curl virus, SPLCV)、甘薯中国曲叶病毒(Sweet potato leaf curl China virus, SPLCCNV)、甘薯乔治亚曲叶病毒(Sweet potato leaf curl Geogia virus, SPLCGoV)3个种,甘薯上海曲叶病毒(Sweet potato leaf curl Shanghai virus, SPLCShV)和甘薯日本曲叶病毒(Sweet potato leaf curl Japan virus, SPLCJV)2个暂定种,以及甘薯中国四川曲叶病毒(Sweet potato leaf curl China Sichuan virus, SPLCCS)、甘薯河南曲叶病毒Sweet potato leaf curl Henan virus (SPLCHnV)、甘薯广西曲叶病毒(Sweet potato leaf curl Guangxi virus, SPLCGxV)和甘薯河南4曲叶病毒(Sweet potato leaf curl Henan4virus, SPLCHn4V)4个新种。SPLCV的发生频率最高,达37.3%；其次为SPLCShV (17.6%), SPLCHn4V和SPLCCNV发生频率分别为11.8%和2.0%,相对较低。甘薯双生病毒在我国三大薯区均有分布,54.9%的阳性样品表现出卷叶症状。 2)中国甘暮双生病毒的分子变异：中国甘薯双生病毒51个不同分离物的基因组核酸序列相似性在78.6%-99.9%之间。SPLCV19个分离物核酸序列相似性在91.3%-99.9%之间,种内变异最大；SPLCJV7个分离物的核酸序列相似性在98.7%-99.8%之间,种内变异相对较小。进化树分析显示中国甘薯双生病毒可分为9个分支。中国甘薯双生病毒64个CP基因的核酸序列相似性在84.5%-100%之间,在进化树上聚为两个大的分支。 3)甘暮双生病毒4个新种的全序列及重组分析：获得了4个甘薯双生病毒新种的基因组全长序列。SPLCCSV基因组全长2764nts,与SPLCCNV的核酸序列相似性最高(84.8%)；重组分析发现SPLCCSV含有由SPLCV-GZ01和SPLCV-Merremia N4重组而来的序列。SPLCHnV基因组全长2766nts,与SPLCCSV的核酸序列相似性最高(89.0%),其AC2、 AC3基因是由SPLCCNV-[CN:05]与SPLCV-CE[BR:Forl]重组而来,非编码区(IR区)含有SPLCBeV和SPLCCNV-ZJ重组而来的序列。SPLCGxV基因组全长2831nts,与SPLCCSV核酸序列相似性最高(88.3%)；它含有由SPLCCNV-[Sichuan14:2012]与SPLCShV重组而来的序列。SPLCHn4V基因组全长2826nts,与SPLCCNV核酸序列相似性最高(89.7%),含有由SPLCV-J508, SPLCV-[Guangxi2:2012]和SPLCV重组而来的序列。 4)甘暮双生病毒的检测方法研究： ①SPLCCSV和SPLCV CP基因的原核表达及抗血清制备；在大肠杆菌中高效表达了SPLCCSV和SPLCV的CP基因,以表达的蛋白为抗原免疫家兔,制备了SPLCCSV和SPLCV两种病毒的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,SPLCCSV抗血清的效价为1:5000,SPLCV抗血清效价为1：2000。两种抗血清均可用于田间甘薯样品的检测。 ②多重PCR检测方法的建立：通过设计针对SPLCV、 SPLCGoV和SPLCHn4V三种双生病毒的特异性引物,优化多重PCR反应条件,建立了能同时检测这三种甘薯双生病毒的多重PCR方法。该方法能有效区分三种病毒,最低检测拷贝数分别为2.46×104拷贝/μL、1.47×104拷贝/μL和1.58×104拷贝/μL。 ③基于深度测序技术的甘暮双生病毒检测方法：首次将深度测序技术应用于甘薯双生病毒的检测,通过提取甘薯样品的总DNA,经RCA、构建DNA文库、高通量测序、数据质量控制、病毒片段拼接比对及PCR验证,共检测到7种甘薯双生病毒。 5) SPLCCSV侵染性克隆的构建：利用无缝连接技术构建了SPLCCSV的侵染性克隆。农杆菌介导法接种病毒3周后,本氏烟系统叶出现轻微的皱缩、起泡和黄化症状,利用PCR方法从本氏烟的系统叶中检测到了SPLCCSV的存在,初步证明了侵染性克隆SPLCCSV的活性。
【关键词】：甘薯双生病毒 种类鉴定 变异 检测方法 侵染性克隆
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S435.31
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 绪论11-25
• 1.1 双生病毒简介11-22
• 1.1.1 双生病毒的发生与危害11-12
• 1.1.2 双生病毒的分类与命名规则12-16
• 1.1.3 双生病毒的变异16-18
• 1.1.4 双生病毒的检测方法18-21
• 1.1.5 双生病毒侵染性克隆的构建21-22
• 1.2 甘薯双生病毒研究进展22-24
• 1.2.1 甘薯的重要地位及产业现状22
• 1.2.2 甘薯双生病毒的发生与危害22-23
• 1.2.3 甘薯双生病毒的种类和变异23-24
• 1.3 本研究的目的和意义24-25
• 1.3.1 我国甘薯双生病毒病研究有待深入探究的问题24
• 1.3.2 本研究的目的和意义24-25
• 第二章 中国甘薯双生病毒的种类、发生频率及分布25-40
• 2.1 试验材料25-26
• 2.1.1 供试甘薯样品25
• 2.1.2 菌株和载体25
• 2.1.3 试剂(盒)和酶25
• 2.1.4 引物25-26
• 2.2 试验方法26-29
• 2.2.1 基本的分子生物学方法26-28
• 2.2.2 甘薯双生病毒的PCR检测28
• 2.2.3 DNA β的检测28
• 2.2.4 DNA-B组份的检测28
• 2.2.5 甘薯双生病毒的RCA检测28-29
• 2.2.6 序列分析方法29
• 2.2.7 病毒分布及发生频率统计29
• 2.3 结果与分析29-38
• 2.3.1 中国甘薯双生病毒的种类29-32
• 2.3.2 中国甘薯双生病毒的发生频率及分布32-33
• 2.3.3 缺陷型干扰DNA分子的克隆和分析33
• 2.3.4 甘薯双生病毒4个新种的全基因组序列特征33-37
• 2.3.5 与甘薯双生病毒侵染相关的症状37-38
• 2.4 小结38-40
• 第三章 中国甘薯双生病毒的分子变异40-56
• 3.1 试验材料40-41
• 3.1.1 供试甘薯样品40
• 3.1.2 试剂(盒)和酶40
• 3.1.3 引物40-41
• 3.2 试验方法41-42
• 3.2.1 甘薯双生病毒CP基因的扩增41
• 3.2.2 不同甘薯DNA的RCA-RFLP分析41
• 3.2.3 中国甘薯双生病毒全基因组序列及CP基因的分子变异41-42
• 3.2.4 甘薯双生病毒4个新种的重组分析42
• 3.3 结果与分析42-55
• 3.3.1 中国甘薯双生病毒基因组序列的种间和种内变异分析结果42-46
• 3.3.2 不同甘薯DNA的RCA-RFLP研究结果46-47
• 3.3.3 中国甘薯双生病毒CP基因分子变异研究结果47-50
• 3.3.4 甘薯双生病毒4个新种的重组分析结果50-55
• 3.4 小结55-56
• 第四章 甘薯双生病毒的检测方法研究56-76
• 4.1 SPLCCSV和SPLCV CP基因的原核表达及抗血清制备56-60
• 4.1.1 材料与方法56-57
• 4.1.2 结果与分析57-60
• 4.2 三种甘薯双生病毒多重PCR检测方法的建立60-66
• 4.2.1 材料与方法60-62
• 4.2.2 结果与分析62-66
• 4.3 基于深度测序技术的甘薯双生病毒的检测与挖掘66-74
• 4.3.1 材料与方法66-68
• 4.3.2 结果与分析68-74
• 4.4 小结74-76
• 第五章 SPLCCSV侵染性克隆的构建76-81
• 5.1 试验材料76
• 5.1.1 供试材料和菌株76
• 5.1.2 试剂(盒)和酶76
• 5.2 试验方法76-78
• 5.2.1 侵染性克隆的构建方法76-77
• 5.2.2 农杆菌介导的病毒接种77-78
• 5.3 结果与分析78-80
• 5.3.1 SPLCCSV侵染性克隆的构建78-79
• 5.3.2 SPLCCSV侵染性克隆的致病性79-80
• 5.4 小结80-81
• 第六章 结论与讨论81-87
• 6.1 结论81-82
• 6.1.1 初步明确了中国甘薯双生病毒的种类、发生频率和分布81
• 6.1.2 明确了中国甘薯双生病毒的分子变异情况81-82
• 6.1.3 制备了SPLCCSV和SPLCV的特异性抗血清82
• 6.1.4 建立了三种甘薯双生病毒的多重PCR检测方法82
• 6.1.5 建立了基于深度测序技术的甘薯双生病毒检测方法82
• 6.1.6 构建了SPLCCSV的侵染性克隆82
• 6.2 创新点82
• 6.3 讨论与展望82-87
• 6.3.1 甘薯双生病毒的多样性82-84
• 6.3.2 甘薯双生病毒的变异84
• 6.3.3 中国甘薯双生病毒的检测方法84-86
• 6.3.4 甘薯双生病毒侵染性克隆的构建86-87
• 参考文献87-98
• 致谢98-99
• 附录99-102
• 作者简介102-103

【参考文献】

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本文编号：427580