JAKs-STATs信号通路关键基因在家兔肠炎发生中的作用研究

发布时间：2017-06-07 20:02

  本文关键词：JAKs-STATs信号通路关键基因在家兔肠炎发生中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：家兔肠炎是养兔业中危害最严重的消化道代谢疾病。根据肠炎病因的来源,可以将肠炎分为已知病原体的肠炎(肠炎)和未知病因的肠炎(非特异性肠炎)两大类。目前普遍认为肠炎的发生主要与遗传、免疫、环境等因素有关,然而相关发病机制尚不清楚,有待深入深究。JAKs-STATs信号通路广泛参与机体细胞的增殖、分化、存活、凋亡,介导机体免疫调控和肿瘤发生等生命活动过程,且有报道指出IL-23R-JAKs-STAT3信号通路与人类的炎症性肠病(IBD)相关。因此,本试验期望从JAKs和STATs两大基因家族中,找到与家兔肠炎相关基因的cSNP,并探讨JAKs-STAT3信号通路在家兔肠炎发病过程中的分子作用机制。本试验采用case-control实验设计,以480只新西兰兔(case 253只,control 227只)为试验对象,筛查JAK1, JAK2, TYK2, STAT1, STAT3和STAT5a基因的cSNP,并进行JAK1, STAT3基因与肠炎易感性的关联性分析；在低纤维日粮诱导家兔肠炎群体中(60只),检测JAK1, STAT3基因在回肠、结肠组织中的mRNA表达水平；通过培养家兔原代小肠上皮细胞(IEC)并用LPS构建家兔IEC炎症细胞模型；在炎症细胞模型中筛选有效下调JAKs(JAK1, JAK2和TYK2)基因表达水平的高效siRNA分子和Western blot检测STAT3蛋白表达水平,并利用RAN-Seq技术对转染si-JAK1的IEC炎症细胞模型组及对照组进行转录本的测序验证,分析JAKs-STAT3在家兔肠炎发病中的不同作用。获得以下主要结果：1. 利用PCR产物纯化后直接测序法,筛查新西兰兔JAKs和STATs两个家族六个基因的编码区cSNP,共发现22个cSNP,分别是JAK1 3个,JAK21个,TYK25个,STAT15个,STAT3 4个和STAT5 α4个。其中,JAK1 c.1421 CT和TYK2c.1477 CT是非同义突变,分别导致氨基酸p.Thr 474 Met (TM)和p.Leu 404 Phe (LF)的改变,其余的cSNP均为同义突变。通过非同义突变导致氨基酸损害程度分析和同义突变密码子偏好性分析,选择JAK1 c.1421, c.3036和STAT3 c.399, c.831四个cSNP进行家兔肠炎case-control关联性分析,结果发现JAK1等位基因C(c.1421)和A(c.3036)分别是风险等位基因和保护等位基因；STAT3等位基因C(c.831)和G(c.399)分别是风险等位基因和保护等位基因。运用多因子降维法(MDR)分析JAK1(c.1421 CT、 c.3036 AG)和STAT3 (c.399 GA、c.831 TC)基因的遗传交互作用,结果发现四个cSNP组成8个遗传交互作用模型,其中7个模型对家兔肠炎的易感性存在交互作用,模型(命名:c1421,c3036, c831)显著地与家兔肠炎易感性相关(OR:2.7262; 95% CI:4.7408-5.1986; P0.0001)。2. 在低纤维日粮诱导试验的家兔群体中,荧光定量PCR(qPCR)试验分析发现JAK1 (c.1421 CT)基因在回肠和结肠中的严重组表达量最高,分别为0.2398±0.0145 和 0.1835±0.0175。JAK1基因在严重组回肠中的表达量极显著高于健康组(P=0.0056),显著高于轻微炎症组(P=0.039)。在回肠中CC基因型的表达量与CT和TT基因型表达量的差异分别达到显著水平(P=0.031)和极显著水平(P=0.0082)；在结肠中只有CC基因型与TT基因型的mRNA表达量呈现显著相关(P=0.026)。STAT3(c.399 GA)基因在回肠和结肠中的严重组表达量最高,分别为0.3598±0.0249和0.2881±0.0671。STAT3基因在严重组回肠中的表达量极显著高于健康组(P=.0089),显著高于轻微炎症组(P=0.013),健康组和轻微组相互之间差异也达到显著水平(P=0.045)。在回肠中AA基因型的表达量与GG基因型表达量的差异达到极显著水平(P=0.0012)；在结肠中AA基因型与AG、GG基因型的mRNA表达量均呈现显著相关(P=0.036,P=0.029),而AG和GG基因型之间的mRNA表达水平差异不显著(P=0.219)。3.采用胶原酶I (0.2 mg/ml)成功分离培养家兔原代IEC,运用相差消化法及相差贴壁法纯化IEC,经CK-18单克隆抗体鉴定其纯度达95%以上。纯化后的IEC培养体系中添加终浓度为1000 ng/ml的LPS并作用24 h,再利用ABC-ELISA法检测到LPS模型组中IL-1β、TNF-α两个经典的急性炎症早期细胞因子含量均显著高于同时段对照组(P0.01),结果表明LPS诱导兔IEC炎症细胞模型构建成功。4.利用阳性对照si-Pcontrol-GAPDH和荧光Cy3标记的阴性对照si-Ncontrol 05815确定了最佳脂质体转染体系,获得能够有效下调JAK1,JAK2和TYK2基因表达的siRNA分子(si-JAK1-001, si-JAK2-001和si-TYK2-003)。通过调整siRNA转染的终浓度,使其沉默靶基因的效率基本一致(70%),通过qPCR检测STAT3基因在已转染高效siRNA的炎症细胞模型中mRNA表达水平,以及利用Westeren blot分析p-STAT3(Tyr 705)和STAT3,总蛋白的表达量,结果发现JAK1、JAK2、 TYK2分别下调STAT3基因的mRNA表达水平为76.34%、23.89%和42.14%,分别下调p-STAT3表达水平0.71%,0.24%和0.35%,而总蛋白水平却没有明显变化,表明JAK1是导致STAT3 (Tyr 705)位磷酸化的主因。5. 通过RNA-Seq技术对转染si-JAKl-001的IEC炎症细胞模型和对照组的测序,结果发现采用RNA fragmentation策略构建测序文库可以获得良好的测序随机性和较高质量的测序数据,与参考基因比对率约为40.05%,并且大约65%基因的Coverage达到90-100%。RNA-Seq基因差异表达分析发现两组重复试验有491个上调基因,780个下调基因,涉及到压力应答,类固醇激素刺激应答以及免疫系统发育等生物学过程。RNA-Seq进一步证实si-JAK1-001可以有效沉默JAK1基因。Pathway显著性富集分析揭示JAKs-STATs信号通路中相关基因的功能与家兔IEC炎症细胞模型的免疫应答相关,且JAK1选择性显著下凋STAT1、STAT3、STAT5b基因的表达水平。本研究着重揭示JAK1和STAT3基因与家兔肠炎易感性的关系；阐述JAK1是激活STAT3(Tyr705)位磷酸化的主因,从而加剧家兔肠炎的发生,为家兔肠炎的分子抗病育种和JAKs、STATs激酶抑制剂的研发提供理论依据。
【关键词】：肠炎 JAKs-STATs cSNP siRNA RNA-Seq
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.291
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 专业术语缩写表10-17
• 第一章 文献综述17-41
• 1 家兔消化系统和肠道免疫的特征17-19
• 2 家兔肠炎研究进展19-24
• 2.1 家兔肠炎的分类19-20
• 2.2 家兔肠炎的防治20
• 2.3 肠炎免疫的分子机制20-24
• 2.3.1 IBD的发病机制20-21
• 2.3.2 天然免疫与肠炎21-23
• 2.3.3 获得性免疫效应分子与肠炎23-24
• 3 JAKs/STATs信号通路与肠炎的研究进展24-29
• 3.1 JAKs-STATs信号通路的组份24-26
• 3.2 JAKs-STATs信号通路的作用机制26-27
• 3.3 JAKs-STATs信号通路与免疫调节(肠炎)研究进展27-29
• 3.3.1 JAKs-STATs信号通路在肠炎发生中的作用研究进展28
• 3.3.2 JAKs-STATs信号通路在肠炎药物研发中的应用进展28-29
• 4 本试验涉及到的主要分子生物学实验技术29-38
• 4.1 HRM基因分型技术29-31
• 4.1.1 HRM基因分型原理29-30
• 4.1.2 HRM主要技术特点30
• 4.1.3 HRM的发展与应用30-31
• 4.2 RNAi技术的应用31-36
• 4.2.1 RNAi技术历史回顾32
• 4.2.2 RNAi的作用机制32-35
• 4.2.3 RNAi在动物功能基因组研究中的应用35-36
• 4.3 RNA-Seq技术介绍36-38
• 4.3.1 RNA-Seq技术特点37
• 4.3.2 RNA-Seq在畜禽遗传育种研究中的运用37-38
• 5 本试验研究目的及主要内容38-41
• 5.1 本试验目的及意义38-39
• 5.2 本试验的主要内容39-40
• 5.3 本试验技术路线40-41
• 第二章 JAKs和STATs家族基因多态性及相互作用与家兔肠炎易感性分析41-81
• 1 试验材料41-43
• 1.1 case-control肠炎易感性样本群构建及样本采集41-42
• 1.2 低纤维日粮肠炎兔群的构建及样本采集42-43
• 2 仪器设备与试剂配制43-46
• 2.1 主要仪器设备43-44
• 2.2 主要试剂及配制44-46
• 2.2.1 主要试剂盒及试剂44-45
• 2.2.2 主要试剂的配制45-46
• 3 试验方法46-59
• 3.1 低纤维日粮家兔肠炎炎症程度分类46-47
• 3.1.1 临床观察和解剖症状评分46
• 3.1.2 组织病理切片HE染色观察46
• 3.1.3 低纤维诱导试验中家兔炎症严重程度分类46-47
• 3.2 DNA和RNA的提取和检测47-50
• 3.2.1 基因组DNA的提取47-48
• 3.2.2 总RNA抽提48-49
• 3.2.3 DNA、RNA浓度和纯度的检测49
• 3.2.4 cDNA的合成49-50
• 3.3 JAKs和STATs基因引物设计、PCR扩增和cSNP检测50-54
• 3.3.1 引物设计与合成50-52
• 3.3.2 常规PCR反应体系及条件52-53
• 3.3.3 PCR产物的纯化和胶回收53
• 3.3.4 直接测序和变异位点筛选53-54
• 3.4 PCR-RFLP和HRM技术进行基因分型54-56
• 3.4.1 PCR-RFLP基因分型54-55
• 3.4.2 HRM基因分型55-56
• 3.5 JAK1和STAT3基因qPCR分析mRNA表达水平56-57
• 3.6 数据处理57-59
• 3.6.1 主要分子生物学软件57-58
• 3.6.2 多态信息与相关性统计分析58-59
• 3.6.3 qPCR组织表达研究统计分析59
• 4 试验结果与分析59-75
• 4.1 低纤维日粮诱导家兔肠炎炎症程度的分类59-60
• 4.2 基因组DNA和总RNA提取结果60-61
• 4.2.1 基因组DNA提取结果60-61
• 4.2.2 总RNA提取结果61
• 4.3 JAKs和STATs家族基因编码区扩增和直接测序结果61-64
• 4.4 分析筛选关键cSNP位点64-66
• 4.4.1 非同义突变cSNP导致氨基酸损害程度的变化64
• 4.4.2 同义突变cSNP密码子偏好性分析结果64-66
• 4.5 JAK1 c.1421,c.3036和STAT3 c.399,c.831基因分型结果66-68
• 4.5.1 JAK1基因PCR-RFLP分型结果66-67
• 4.5.2 STAT3基因HRM分型结果67-68
• 4.6 JAK1和STAT3基因与家兔肠炎易感性分析68-73
• 4.6.1 JAK1基因c.1421和c.3036对家兔肠炎易感性分析68-69
• 4.6.2 STAT3基因c.399和c.831对家兔肠炎易感性分析69-72
• 4.6.3 JAK1和STAT3基因对肠炎易感性的遗传交互作用分析72-73
• 4.7 JAK1和STAT3基因在回肠和结肠组织mRNA的表达水平分析73-75
• 4.7.1 JAK1基因在回肠和结肠组织mRNA表达水平分析73-74
• 4.7.2 STAT3基因在回肠和结肠组织mRNA表达水平分析74-75
• 5 讨论75-79
• 5.1 分析试验家兔肠炎分组的可靠性75-76
• 5.2 JAKs和STATs两个家族基因cSNP功能性分析76-77
• 5.3 JAK1和STAT3基因cSNP和交互作用影响家兔肠炎易感性77-79
• 5.4 JAK1和STAT3基因回肠和结肠组织mRNA表达水平差异分析79
• 6 本章小结79-81
• 第三章 新生仔兔小肠上皮细胞LPS炎症细胞模型构建81-99
• 1 试验材料与试剂81-85
• 1.1 试验材料81
• 1.2 主要仪器设备及试剂(配制)81-85
• 1.2.1 仪器设备81-82
• 1.2.2 细胞培养耗材82-83
• 1.2.3 主要试剂(盒)购买及配制83-85
• 2 试验方法85-90
• 2.1 家兔原代IEC的分离、培养与纯化85-86
• 2.1.1 IEC原代消化和传代培养法85-86
• 2.1.2 IEC的纯化86
• 2.2 家兔IEC的鉴定86-88
• 2.2.1 IEC形态学观察86-87
• 2.2.2 IEC生长曲线的测定87
• 2.2.3 CK-18单克隆抗体的免疫组化鉴定87-88
• 2.3 IEC炎症细胞模型的构建88-89
• 2.3.1 LPS药物剂量筛选试验88-89
• 2.3.2 LPS刺激IEC炎症细胞模型试验89
• 2.3.3 ABC-ELISA法测定炎症细胞模型中IL-1β和TNF-α89
• 2.4 数据处理89-90
• 3 试验结果与分析90-97
• 3.1 成功分离、培养与纯化家兔IEC90-93
• 3.1.1 IEC的形态学观察90-92
• 3.1.2 IEC生长曲线绘制92
• 3.1.3 CK-18单克隆抗体的免疫组化鉴定92-93
• 3.2 利用LPS成功构建IEC炎症模型93-97
• 3.2.1 确定LPS药物剂量93-95
• 3.2.2 炎症细胞模型中IL-1β、TNF-α的含量显著提高95-97
• 4 讨论97-98
• 4.1 成功分离培养、纯化和鉴定家兔原代IEC97-98
• 4.2 LPS成功诱导兔IEC炎症细胞模型构建98
• 5 本章小结98-99
• 第四章 JAK1,JAK2和TYK2与STAT3基因对家兔IEC炎症发生的作用研究99-121
• 1 试验材料与试剂100-104
• 1.1 细胞的选择100
• 1.2 主要仪器设备及耗材100
• 1.3 主要试剂(配制)100-104
• 1.3.1 细胞培养和转染试剂100-101
• 1.3.2 siRNA序列信息101-102
• 1.3.3 抗体102
• 1.3.4 主要试剂配制102-104
• 2 试验方法104-111
• 2.1 Lip2000转染siRNA进入IEC104-106
• 2.2 qPCR筛选高效下调目的基因表达水平的siRNA分子106
• 2.2.1 细胞RNA的提取106
• 2.2.2 cDNA的合成106
• 2.2.3 qPCR筛选siRNA106
• 2.3 检测STAT3在转染siRNAs炎症细胞模型mRNA和蛋白水平106-111
• 2.3.1 qPCR检测STAT3基因的mRNA表达水平107
• 2.3.2 Western blot分析STAT3蛋白表达水平107-111
• 2.4 ABC-ELISA检测si-JAK1-001 IEC炎症细胞模型中IL-1β和TNF-α的表达水平111
• 2.5 数据分析111
• 3 试验结果与分析111-116
• 3.1 成功构建siRNA的Lip2000转染方法111-113
• 3.2 成功筛选下调目的基因表达水平的si-JAKs113-114
• 3.3 JAKs在IEC炎症细胞模型中激活STAT3的作用114-116
• 3.4 JAK1基因沉默后对IEC炎症模型中IL-1β和TNF-α表达水平的影响116
• 4 讨论116-120
• 4.1 优化Lip2000转染体系116-117
• 4.2 筛选高效的siRNA分子117-118
• 4.3 家兔IEC炎症细胞模型中JAK1是激活STAT3的主要因子118-120
• 5 本章小结120-121
• 第五章 JAK1基因沉默后IEC炎症细胞模型的RNA-Seq表达谱分析121-140
• 1 试验材料与试剂121-122
• 1.1 细胞模型121
• 1.2 主要仪器和试剂121-122
• 1.2.1 主要仪器设备121-122
• 1.2.2 主要试剂122
• 2 试验方法122-128
• 2.1 细胞总RNA的提取和纯化122-123
• 2.2 RNA样品的质量鉴定123
• 2.3 RNA-Seq文库构建及测序123-124
• 2.4 数据分析124-128
• 2.4.1 原始序列数据的处理125-126
• 2.4.2 测序数据质量评估126-127
• 2.4.3 差异表达基因的分析127-128
• 3 结果与分析128-137
• 3.1 纯化后总RNA的检测结果128-129
• 3.2 RNA-Seq数据质量评估报告129-133
• 3.2.1 Raw reads质量评估129
• 3.2.2 Clean reads比对统计结果129-130
• 3.2.3 测序随机性评估结果130-131
• 3.2.4 Reads在基因组上的分布131-132
• 3.2.5 基因覆盖度统计132-133
• 3.3 基因差异表达分析133-137
• 3.3.1 case-control差异表达基因筛选133-134
• 3.3.2 GO功能显著性富集分析134-136
• 3.3.3 Pathway显著性富集分析136-137
• 4 讨论137-139
• 4.1 试验设计和测序方案的选择137-138
• 4.2 JAKs-STATs在IEC炎症细胞模型中分子作用的研究138-139
• 5 本章小节139-140
• 第六章 研究结论与展望140-142
• 1 本研究主要结论140
• 2 本研究的主要创新点140-141
• 3 下一步研究展望141-142
• 参考文献142-155
• 致谢155-156
• 攻读学位期间完成的学术成果156

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1 付陆;JAKs-STATs信号通路关键基因在家兔肠炎发生中的作用研究[D];四川农业大学;2015年

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