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碳青霉烯不敏感大肠杆菌分子特征及NDM-1适应性代价研究

发布时间:2017-06-07 20:08

  本文关键词:碳青霉烯不敏感大肠杆菌分子特征及NDM-1适应性代价研究,,由笔耕文化传播整理发布。


【摘要】:碳青霉烯类抗生素是在人医临床上能够有效治疗由携带超广谱β内酰胺酶或头孢西丁酶肠杆菌引起的严重感染的最重要的药物之一,但是,随着碳青霉烯类抗生素在人医临床上的应用不断增加,碳青霉烯类抗生素耐药肠杆菌也呈现出不断增长的态势。肠杆菌产生对碳青霉烯抗生素的耐药主要原因就是获得外源性的碳青霉烯酶,其中KPC型和NDM型碳青霉烯酶是目前流行最广的两种。大肠杆菌是人医临床和兽医临床上最常见的肠杆菌之一,也是条件性致病菌和体内共生菌,其所带来的危害是十分严重的,近年来碳青霉烯耐药大肠杆菌在人医临床上的报道有逐年增加的趋势。目前对于碳青霉烯耐药大肠杆菌的研究多集中在人医临床上,对动物源和环境源大肠杆菌碳青霉烯耐药流行病学调查缺乏研究资料。适应性代价是指细菌为适应环境条件变化而做出的改变,耐药性的持续和扩散与适应性代价有关,多数研究表明细菌获得耐药性后,与敏感菌相比其生长力、毒力、稳定性会发生变化,这种变化决定了其能否在宿主体内或体外环境中长久存在。本实验对分离自猪源和水源碳青霉烯类抗生素不敏感大肠杆菌进行耐药分子特征的研究,并研究了bla NDM-1基因在大肠杆菌内的适应性代价。本实验收集了2009年至2014年分离自黑龙江不同地区规模化猪场的猪源大肠杆菌488株和2013年至2014年分离自哈尔滨市马家沟河水源大肠杆菌105株,运用微量肉汤稀释法测定了593株大肠杆菌对22种抗菌药物的MIC值。药敏试验结果显示,猪源和水源大肠杆菌的耐药性都比较严重,多重耐药菌普遍存在,其中对阿莫西林、四环素和复方新诺明的耐药率都超过了90%,两种来源大肠杆菌除了在对阿莫西林/克拉维酸、头孢噻呋、头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、厄他培南、氟苯尼考、环丙沙星、恩诺沙星、多粘菌素和替加环素的耐药率有显著性差异外,对其他抗生素耐药率没有显著性差异。通过MIC值筛选出对碳青霉烯类抗生素厄他培南、亚胺培南和美罗培南不敏感大肠杆菌40株,其中猪源大肠杆菌22株,水源大肠杆菌18株,水源大肠杆菌对厄他培南、亚胺培南和美罗培南三种碳青霉烯类抗生素的MIC50值和MIC90值都大于猪源大肠杆菌,说明水源大肠杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性比猪源大肠杆菌严重。运用改良Hodge试验和EDTA协同试验,对40株碳青霉烯不敏感大肠杆菌进行表型筛选,结果显示12株大肠杆菌改良Hodge试验阳性,5株大肠杆菌EDTA协同试验阳性,说明12株菌为疑似产碳青霉烯酶菌,5株菌为产金属酶菌。PCR方法扩增40株碳青霉烯不敏感大肠杆菌中有可能存在的碳青霉烯酶基因(blaBIC、bla KPC、bla IMP、bla VIM、bla NDM、bla GIM、bla SPM、bla SIM、bla AIM、bla DIM、bla OXA-48)、超广谱β-内酰胺酶基因(bla TEM、bla SHV、bla CTX-M、bla CTX-M-1组、bla CTX-M-2-组、bla CTX-M-8组、bla CTX-M-9-组、bla CTX-M-25-组、bla OXA)、Amp C酶基因(bla MOX、bla CMY、bla DHA、bla ACC、bla EBC、bla FOX)、质粒介导的16Sr RNA甲基化酶基因(arm A、rmt A、rmt B、rmt C、rmt D、rmt E和npm A)和质粒介导的喹诺酮耐药基因(qnr A、qnr B、qnr C、qnrD、qnr S、qep A、oqx AB、aac(6’)-Ib-cr)。结果显示,40株大肠杆菌中,5株菌中检出bla KPC基因,5株菌中检出bla NDM基因,经过测序确定了两种基因的亚型分别为blakpc-2和blandm-1,其他类型的碳青霉烯酶基因没有检出;40株碳青霉烯酶不敏感大肠杆菌中全部扩增出了超广谱β-内酰胺酶基因,其中以blactx-m基因的检出率为最高,检出率为95%(38/40),共检出12种超广谱β-内酰胺酶基因分别为blatem-52、blashv-11、blashv-12、blactx-m-3、blactx-m-15、blactx-m-55、blactx-m-64、blactx-m-14、blactx-m-27、blactx-m-65、blactx-m-125和blaoxa-1基因,其中blatem-52基因是首次在猪源大肠杆菌中检出;11株碳青霉烯不敏感大肠杆菌中检出了ampc酶基因,并且扩增出的都是blacmy基因,其他五种ampc酶基因没有扩增到,经过测序得到了两种基因亚型分别为blacmy-2和blacmy-30;40株碳青霉烯不敏感大肠杆菌中16株检出质粒介导的16srrna甲基化酶基因,其中9株检出arma基因,7株检出rmtb基因;40株碳青霉烯不敏感大肠杆菌中质粒介导的喹诺酮耐药基因的检出率为82.5%(33/40),其中oqxab、qnrs、aac(6’)-ib-cr、qepa基因的检出率分别为55%(22/40)、40%(16/40)、37.5%(15/40)和22.5%(9/40)。运用脉冲场凝胶电泳分型、多位点等位基因序列分型两种方法对40株大肠杆菌进行分子分型,结果显示通过脉冲场凝胶电泳分型技术把40株大肠杆菌分成a~s共19个克隆株,除了c型、f型、g型、i型、k型、m型和r型属于多克隆株外,其他12种克隆菌株都属于单一克隆,证明猪源和水源碳青霉烯不敏感大肠杆菌以单克隆传播为主,其中5株产kpc-2酶大肠杆菌分成5个克隆株,5株产ndm-1酶大肠杆菌分为4个克隆株;通过多位点等位基因序列分型方法将40株大肠杆菌分成了15个st型,其中除了包括cc10、cc23、cc38和cc405共4个克隆复合体外,其他11个st型都属于单一序列型,携带kpc-2酶大肠杆菌属于st69、st131、st405、st410和st648五种不同的st型,携带ndm-1大肠杆菌属于st72、st131、st167和st410四种不同的st型。运用系统发育群分组分型方法对40株碳青霉烯不敏感大肠杆菌进行分型,结果24株属于致病力弱的a型和b1型,16株属于致病力强的b2型和d型,携带kpc-2酶大肠杆菌有3株属于强致病力组,2株属于弱致病力组,携带ndm-1酶大肠杆菌有4株属于弱致病力组,只有1株属于强致病力组,同时具备强致病力和强耐药性的菌株对人医临床是个威胁。运用接合实验的方法验证碳青霉烯耐药机制的可转移性,结果显示40株碳青霉烯不敏感大肠杆菌中12株接合成功,携带kpc-2酶的5株大肠杆菌和携带ndm-1的大肠杆菌都接合成功,并在接合子中扩增到了相应的基因,证明了blakpc-2基因和blandm-1基因位于质粒上可以水平移动,在接合成功的产kpc-2酶接合子中扩增到了两种质粒复制子分别为incn和inca/c,在产ndm-1酶接合子中也扩增到了两种质粒复制子分别为inca/c和incfii,证明是这三种质粒介导了blakpc-2基因和blandm-1的水平传播。采用引物步移法对5株产ndm-1酶大肠杆菌中的blandm-1基因周围环境进行分析,结果显示blandm-1基因具有三种不同的基因环境,其中一种基因环境和鲍曼不动杆菌中blandm-1基因环境完全吻合,证明耐药质粒在肠杆菌和鲍曼不动杆菌之间发生了传递,另外两种是典型的肠杆菌中blandm-1基因环境特征。体外构建含有blandm-1启动子在内的克隆载体导入大肠杆菌dh5α,通过测定生长曲线和体外竞争常数分析blandm-1基因对大肠杆菌的适应性代价,结果显示blandm-1基因对大肠杆菌的生长没有显著的影响,blandm-1基因在大肠杆菌中的适应性常数为0.93,属于较弱的适应性代价。通过测定bla NDM-1基因对大肠杆菌的适应性代价常数,证明大肠杆菌一旦获得bla NDM-1基因,这种基因可以在大肠杆菌中稳定传播。
【关键词】:大肠杆菌 碳青霉烯酶 KPC-2 NDM-1 分子特征 适应性代价
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S852.61
【目录】:
  • 摘要10-13
  • 英文摘要13-16
  • 1 引言16-30
  • 1.1 碳青霉烯类抗生素16-17
  • 1.2 碳青霉烯类抗生素耐药机制17-22
  • 1.2.1 产生碳青霉烯酶17-21
  • 1.2.2 其他耐药机制21-22
  • 1.3 NDM-1 酶研究进展22-27
  • 1.3.1 NDM-1 酶特点23-24
  • 1.3.2 产NDM-1 酶大肠杆菌流行现状24-25
  • 1.3.3 产NDM-1 酶大肠杆菌的传播和耐药机制25-26
  • 1.3.4 产NDM-1 酶大肠杆菌的实验室诊断26
  • 1.3.5 产NDM-1 酶大肠杆菌感染的治疗26-27
  • 1.4 适应性代价27-29
  • 1.5 研究目的与意义29-30
  • 2 材料和方法30-57
  • 2.1 材料30-33
  • 2.1.1 菌株来源30
  • 2.1.2 药物30-31
  • 2.1.3 主要试剂31-32
  • 2.1.4 主要溶液的配制32
  • 2.1.5 仪器设备32-33
  • 2.2 方法33-57
  • 2.2.1 细菌的复苏33
  • 2.2.2 细菌的分离与保存33-34
  • 2.2.3 药敏试验34-37
  • 2.2.4 表型试验37
  • 2.2.5 碳青霉烯酶耐药基因检测37-41
  • 2.2.6 其他耐药基因检测41-44
  • 2.2.7 PFGE分型44-47
  • 2.2.8 多位点序列分型47-48
  • 2.2.9 系统发育群分型48-49
  • 2.2.10 质粒接合试验49-52
  • 2.2.11 bla NDM-1 基因周围序列检测52-54
  • 2.2.12 bla NDM-1 基因适应性代价54-55
  • 2.2.13 数据统计55-57
  • 3 结果与分析57-84
  • 3.1 细菌的复苏与分离结果57
  • 3.2 药敏试验结果57-64
  • 3.2.1 猪源和水源大肠杆菌药敏试验结果57-58
  • 3.2.2 猪源和水源大肠杆菌多重耐药性58-59
  • 3.2.3 碳青霉烯不敏感大肠杆菌耐药性59-64
  • 3.3 表型试验结果64-65
  • 3.3.1 改良Hodge试验64-65
  • 3.3.2 金属酶表型试验65
  • 3.4 碳青霉烯酶检测结果65-67
  • 3.5 其他耐药基因检测结果67-74
  • 3.5.1 β-内酰胺酶基因67-70
  • 3.5.2 16S甲基化酶基因检测结果70-71
  • 3.5.3 PMQR基因检测结果71-74
  • 3.6 PFGE分型结果74-76
  • 3.7 MLST分型结果76-77
  • 3.8 系统发育群分型结果77-79
  • 3.9 接合转移试验结果79-82
  • 3.9.1 接合子药敏试验79-81
  • 3.9.2 接合子质粒复制子分型81-82
  • 3.10 bla NDM-1 基因环境82
  • 3.11 bla NDM-1 基因适应性代价结果82-84
  • 3.11.1 耐药菌与敏感菌生长曲线82-83
  • 3.11.2 耐药菌与敏感菌体外竞争试验83-84
  • 4 讨论84-94
  • 4.1 耐药性分析84-87
  • 4.1.1 猪源大肠杆菌耐药性分析84-86
  • 4.1.2 水源大肠杆菌耐药性分析86-87
  • 4.2 碳青霉烯不敏感大肠杆菌耐药性分析87-88
  • 4.2.1 碳青霉烯不敏感大肠杆菌耐药率87
  • 4.2.2 碳青霉烯不敏感大肠杆菌表型筛选分析87-88
  • 4.3 碳青霉烯不敏感大肠杆菌耐药基因分析88-89
  • 4.4 碳青霉烯不敏感大肠杆菌分型方法分析89-91
  • 4.5 接合实验分析91-92
  • 4.6 bla NDM-1 基因周围环境分析92-93
  • 4.7 bla NDM-1 基因适应性代价分析93-94
  • 5 结论94-95
  • 致谢95-96
  • 参考文献96-115
  • 攻读博士学位期间发表的学术论文115

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 余方友;;16S rRNA甲基化酶导致的氨基糖苷类抗生素高水平耐药研究进展[J];实验与检验医学;2011年05期

2 李树娟;岳磊;廖晓萍;蒋智钢;陈雪影;阳艳林;张悦;黄楚艳;刘雅红;;哺乳母猪肠杆菌PMQR基因的检测[J];中国农业科学;2010年08期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 胡燕燕;耐碳青霉烯革兰阴性杆菌分子流行病学及MALDI-TOF MS在碳青霉烯耐药决定子快速检测中的应用研究[D];浙江大学;2014年


  本文关键词:碳青霉烯不敏感大肠杆菌分子特征及NDM-1适应性代价研究,由笔耕文化传播整理发布。



本文编号:430148

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