稻曲病菌基因敲除体系的建立及HOG1基因在稻曲病菌和禾谷镰刀菌中功能验证

发布时间：2017-06-10 19:08

  本文关键词：稻曲病菌基因敲除体系的建立及HOG1基因在稻曲病菌和禾谷镰刀菌中功能验证，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：水稻稻曲病是由病原真菌Ustilaginoidea virens引起的一种水稻穗部病害。该病害目前在世界范围流行,并已经成为我国水稻生产的主要病害,不仅导致了水稻产量的损失,而且会合成对人畜和植物有害的稻曲菌素,危害粮食安全。现阶段对该病害的研究尚处于起步阶段,对其生活史、侵染类型等基本问题尚未完全明确。目前针对稻曲病菌基因功能的研究主要通过病原菌表达谱分析,或是通过对随机插入突变体库进行性状筛选进行,尚没有针对该病原菌基因敲除体系的报道。由于基因敲除突变体的获得是基因功能鉴定的基础,该体系的缺失严重制约了稻曲病菌基因功能的研究。本试验通过分析和比较丝状真菌中常用的遗传转化方法,选取了根癌农杆菌介导的遗传转化体系(ATMT)以及PEG介导的原生质体转化方法对稻曲病菌的基因敲除进行尝试,并在ATMT体系基础上成功的对稻曲病菌HOG1基因进行了敲除。试验首先对双元转化载体p CAMBIA1300进行了改造,获得了稻曲病菌基因敲除的载体p CBDW以及回复突变载体p CBDW-GEN,并在此基础上构建了Uv HOG1基因的敲除载体和回复突变载体。随后通过对ATMT体系进行改进和调整,建立了稻曲病菌的基因敲除体系,并在617个转化子中成功筛选到了Uvhog1突变体。试验利用所建立的敲除体系进一步对5个非核糖体肽NRPS基因进行敲除试验,结果表明该基因敲除体系可以应用于稻曲菌一般基因的敲除,其同源重组概率为1.67%。在基因功能鉴定方面,试验所获得的Uvhog1突变体在营养生长过程表现生长速度的减慢,菌丝间分支角度减小,色素的合成受到抑制;虽然分生孢子及萌发的形态均未受到影响,但产孢量明显的下降。Uv HOG1基因的缺失不仅导致了突变体对渗透压敏感程度的升高,还导致了Uvhog1突变体无法通过山梨醇和甘油等相容性物质的积累对细胞内外渗透压进行平衡,同时,与氧化压力相关的转录因子Uv ATF1和Uv SKN7也由于Uv HOG1的缺失而无法正常表达。此外,Uvhog1突变体对细胞膜压力表现出很高的敏感性,而在细胞壁的压力下没有明显的表型。在水稻种子萌发过程中,Uvhog1突变体培养物的滤液对水稻幼苗生长的抑制作用有所减弱。与稻曲病相比,小麦赤霉病主要是由Fusarium graminearum引起的一种小麦病害。该病害在全世界范围内的发生逐渐趋于频繁,在影响小麦产量的同时,还会产生DON等毒素,降低谷物品质并造成食品安全问题。为了更为全面的验证HOG1基因在不同病原真菌中的功能,实验对F.graminearum中HOG1信号通路的同源基因Fg SSK2,Fg PBS2以及Fg HOG1分别进行了敲除和功能验证。该信号通路中任一基因的缺失导致了突变体生长速度的减慢以及分生孢子产量的下降;突变体在对渗透压敏感度提高的同时,也部分丧失了通过积累甘油、甘露醇、阿拉伯醇以及蔗糖平衡细胞内外渗透压的能力;此外,各突变体还表现出了对氧化压力、细胞膜压力敏感度的提高,以及对细胞壁压力的耐受性。Fg HOG1通路的突变体还丧失了有性生殖过程中的雌性生殖能力,并且各突变体的致病力及DON毒素的合成能力均有明显下降。本试验首次建立了针对稻曲病菌的基因敲除体系,并成功获得了Uvhog1突变体,为稻曲病菌基因组功能分析提供了方法上强有力的支持。另一方面,通过分析和比较F.graminearum和U.virens中HOG1基因的功能,更为全面的验证了该基因在营养生长、分生孢子的产生、压力应答、细胞完整性、有性生殖以及致病力和毒性方面的保守性及差异性,也为水稻稻曲病和小麦赤霉病的防控提供了一定的理论依据。
【关键词】：稻曲病 基因敲除 HOG1 小麦赤霉病
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S435.111.4
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-15
• 第1章 文献综述15-30
• 1.1 水稻稻曲病概述及研究现状15-20
• 1.1.1 稻曲病菌的分类学地位15-16
• 1.1.2 病害特征和侵染循环16-17
• 1.1.3 水稻稻曲病的流行学特征17-18
• 1.1.4 稻曲病菌的分离、培养及人工接种体系18
• 1.1.5 稻曲菌素的毒性及合成18
• 1.1.6 稻曲病的防治18-19
• 1.1.7 稻曲病的分子遗传学研究19-20
• 1.2 小麦赤霉病概述及研究现状20-23
• 1.2.1 小麦赤霉病病害循环21-22
• 1.2.2 小麦赤霉病的防治22
• 1.2.3 F. graminearum交配型22
• 1.2.4 DON的合成22
• 1.2.5 F. graminearum的分子生物学研究22-23
• 1.3 蛋白磷酸化激酶信号通路23-24
• 1.3.1 酵母中的MAPK信号通路23-24
• 1.3.2 丝状真菌中的HOG1信号通路24
• 1.4 丝状真菌遗传转化体系24-27
• 1.4.1 Li Ac转化体系25
• 1.4.2 REMI转化体系25
• 1.4.3 电激转化25
• 1.4.4 基因枪25-26
• 1.4.5 PEG介导的原生质体转化26
• 1.4.6 根癌农杆菌介导的遗传转化体系26-27
• 1.4.7 稻曲病菌的遗传转化体系27
• 1.5 本课题的立题依据、研究目的及内容27-30
• 1.5.1 课题的立题依据、目的和创新点27-28
• 1.5.2 课题内容28-29
• 1.5.3 课题研究的技术路线29-30
• 第2章 稻曲病菌基因敲除体系的建立30-45
• 2.1 材料与方法30-39
• 2.1.1 材料30-32
• 2.1.1.1 质粒30
• 2.1.1.2 菌株30-31
• 2.1.1.3 主要培养基成分31
• 2.1.1.4 主要试剂及服务31
• 2.1.1.5 主要仪器31-32
• 2.1.1.6 软件及数据库32
• 2.1.2 方法32-39
• 2.1.2.1 pCAMBIA1300质粒改造32-33
• 2.1.2.2 UvHOG1敲除载体的获得33-35
• 2.1.2.3 质粒pCBDW GEN的构建35
• 2.1.2.4 UvHOG1回复突变载体及农杆菌菌株的获得35-36
• 2.1.2.5 稻曲病菌UvHOG1基因敲除体系的建立36-37
• 2.1.2.6 转化子DNA的小量快速提取37
• 2.1.2.7 转化子DNA的PCR检测37-38
• 2.1.2.8 转化子的Southern杂交验证38-39
• 2.1.2.9 Uvhog1突变体的回复突变39
• 2.2 结果39-43
• 2.2.1 UvHOG1敲除载体及功能互补载体的获得39-40
• 2.2.2 转化子的PCR检测结果40-42
• 2.2.3 转化子UVHG653的southern杂交验证结果42
• 2.2.4 回复突变体菌株的获得42-43
• 2.3 小结43-45
• 第3章 UvHOG1基因的功能鉴定45-59
• 3.1 材料与方法45-48
• 3.1.1 材料45-46
• 3.1.1.1 水稻种子45
• 3.1.1.2 主要培养基成分45
• 3.1.1.3 主要试剂45
• 3.1.1.4 主要仪器45-46
• 3.1.2 方法46-48
• 3.1.2.1 在不同培养基平板上的培养46
• 3.1.2.2 菌落边缘的观察46
• 3.1.2.3 分生孢子的收集和萌发46
• 3.1.2.4 各种压力筛选的浓度46-47
• 3.1.2.5 RNA提取、纯化、反转及实时荧光定量PCR检测47
• 3.1.2.6 相容性代谢产物的检测47-48
• 3.1.2.7 突变体对水稻萌发的抑制作用48
• 3.2 实验结果48-57
• 3.2.1 Uvhog1突变体的营养生长，分生孢子产生以及色素的形成48-52
• 3.2.2 Uvhog1突变体在不同压力筛选下的表型52-53
• 3.2.3 Uvhog1基因的敲除对UvATF1、UvSKN7和UvAP1基因表达水平的影响53-54
• 3.2.4 Uvhog1突变体在渗透压条件下甘油和山梨醇的积累54
• 3.2.5 Uvhog1突变体培养液对水稻种子萌发的影响54-56
• 3.2.6 Uvhog1突变体内uv_ustA基因的表达情况56-57
• 3.3 小结57-59
• 第4章 小麦赤霉病菌中FgHOG1信号通路的功能鉴定59-78
• 4.1 材料与方法59-63
• 4.1.1 材料59-60
• 4.1.1.1 菌株59
• 4.1.1.2 主要培养基成分59-60
• 4.1.1.3 主要试剂60
• 4.1.1.4 主要仪器60
• 4.1.2 方法60-63
• 4.1.2.1 突变体的获得及验证60-61
• 4.1.2.2 Fghog1回复突变体的获得及亚细胞定位61
• 4.1.2.3 菌株在不同培养基上的培养61
• 4.1.2.4 分生孢子的收集和萌发61
• 4.1.2.5 菌落表面疏水性的测试61
• 4.1.2.6 菌落边缘观察61-62
• 4.1.2.7 各种压力筛选的浓度62
• 4.1.2.8 相容性代谢产物的测定62
• 4.1.2.9 有性生殖62
• 4.1.2.10 致病力的检测62-63
• 4.1.2.11 侵染过程的半薄切片观察63
• 4.1.2.12 DAPI染色63
• 4.2 结果63-76
• 4.2.1 Fgssk2、Fgpbs2和Fghog1突变体的获得及Southern杂交验证63-64
• 4.2.2 FgHOG1信号通路对F. graminearum营养生长的影响64-67
• 4.2.3 FgHOG1信号通路在不同压力筛选下的营养生长67-70
• 4.2.4 Fghog1突变体在渗透压条件下细胞内相容性物质的积累70
• 4.2.5 Fghog1突变体的有性生殖能力70-72
• 4.2.6 FgHOG1信号通路对于致病力的重要性72-75
• 4.2.7 FgHOG1基因的亚细胞定位75-76
• 4.3 小结76-78
• 第5章 讨论78-88
• 5.1 双元转化载体的改造过程78-79
• 5.2 稻曲病菌不同转化方法之间的比较79-82
• 5.2.1 通过ATMT体系对UvHOG1基因进行敲除的同源重组概率80
• 5.2.2 ATMT体系在稻曲病菌基因敲除过程中的一般效率80-81
• 5.2.3 PEG介导的原生质体遗传转化体系81-82
• 5.2.4 电激转化82
• 5.3 U. virens和F. graminearum中HOG1同源基因功能的分析与比较82-88
• 5.3.1 UvHOG1的进化树分析82-84
• 5.3.2 HOG1对U. virens和F. graminearum营养生长的调控84
• 5.3.3 HOG1在渗透压调节过程中的作用84-85
• 5.3.4 HOG1在其他压力胁迫下的表型85
• 5.3.5 HOG1与压力胁迫相关转录因子间的关系85-86
• 5.3.6 HOG1的缺失对突变体致病力的影响86-88
• 第6章 总结与展望88-90
• 参考文献90-104
• 附表 本文所使用引物序列104-107
• 英文缩写表107-109
• 致谢109-111
• 作者简介111

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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本文编号：439564