稻瘟病菌DNA结合蛋白Pcg2和MoSub1 DNA结合活性的结构基础

发布时间：2017-06-19 20:08

  本文关键词：稻瘟病菌DNA结合蛋白Pcg2和MoSub1 DNA结合活性的结构基础，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是引起水稻稻瘟病的病原,被评选为十大植物病原真菌之首。由于水稻在世界粮食安全上的重要地位以及稻瘟菌的一些独特的生物学特性,稻瘟病菌己成为研究真菌特别是丝状真菌与植物相互作用的模式生物。因此,了解稻瘟菌的致病分子机理不仅有利于稻瘟病的防治,对其它病原真菌的研究也具有指导意义。DNA结合蛋白是生物体内一类非常重要的蛋白,参与调控DNA的复制、转录、重组、修复、重排等众多生化进程,从而影响生长发育进程以及病原菌的致病侵染过程等。本研究通过结构生物学手段对稻瘟菌中两个DNA结合蛋白Pcg2和MoSubl的DNA结合机制进行了研究。前期研究表明Pcg2是稻瘟菌中的一个APSES类转录因子,能够结合顺式作用元件MCB和SCB,并在稻瘟病菌的致病过程中发挥重要的作用。稻瘟病菌却cg2缺失突变体几乎丧失对水稻的致病性,而其DNA结合活性是其发挥功能所必需的。作者通过分析型超速离心技术分析了溶液中Pcg2 DNA结合结构域(Pcg2-DBD)与MCB形成复合物的情况。结果表明Pcg2-DBD与MCB可以形成两种不同的复合物：在低浓度下蛋白分子与核酸分子形成以1：1比例为主的复合物,而高浓度下则是以2：1比例形成的复合物为主。而且重组表达的含Pcg2-DBD和ANK区域的截断体Pcg21-424以二聚体形式存在。这些结果表明Pcg2在体内可能是以二体形式结合DNA的。由于Pcg21-424非常易于降解,作者基于已经解析的Pcg2 DBD与MCB复合物的晶体结构,设计了一个二体突变体Pcg2 DBD Q82C,制备了其与SCB以及UN1、BT1等的DNA复合物,并进行了晶体生长条件的筛选。目前已经解析了突变体母体的结构,正在分析未获得DNA复合物晶体的原因并继续进行复合物晶体生长条件的筛选。此外,作者通过SPR技术对模拟磷酸化突变体S123E研究发现,S123位磷酸化对于单独的Pcg2-DBD与MCB和SCB的结合可能并没有明显的影响。遗传分析表明MoSub1可能是氮源缺乏时稻瘟病菌菌丝生长的负调控子.MoSub1是人源PC4和酵母Subl在稻瘟菌中的同源蛋白,它们都拥有高度保守的ssDNA结合结构域,但是其序列及功能又存在着差异,而且这些差异的结构基础尚未见报道。PC4中F77位和W89位是参与结合ssDNA的关键位点。作者分析发现F77在所有的PC4同源物中都是保守的,但W89在包括稻瘟菌MoSub1在内的7个物种的PC4同源物中被酪氨酸Y替换。作者解析了PC4 W89Y突变体与19T1G ssDNA复合物的结构,并将其与稻瘟菌MoSub1-19T1G复合物以及PC4-19T1G复合物的结构进行了比较,发现原本存在于PC4W89位附近的一疏水口袋在等价的MoSub1 Y74位和PC4突变体中的Y89位附近消失了。研究结果表明MoSub1中保守的Y74残基或PC4中W89残基不仅在其与DNA特异性相互作用中起着重要作用,也决定了PC4类ssDNA结合蛋白的DNA结合模式。而DNA结合模式差异与其功能关系有待进一步研究加以确认。此外,作者利用磷酸化模拟突变体和CKII激酶磷酸化样品研究了磷酸化作用对MoSub1的DNA结合活性的影响。结果表明,与PC4和Subl不同,磷酸化作用对MoSub1与ssDNA的亲和力并没有明显的影响。同时,作者还发现磷酸根离子可能影响MoSub1-ssDNA复合物的形成,相关研究正在进行中。上述这些研究对我们深入理解稻瘟菌中DNA结合蛋白Pcg 2和MoSub1与DNA相互作用的分子细节提供了结构基础,也为我们全面揭示它们在病原真菌生长发育和致病过程的生物学功能提供了结构线索。
【关键词】：稻瘟病菌 晶体结构 DNA结合蛋白 Pcg2 MoSub1
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S435.111.41
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 缩略语表9-10
• 第一章 绪论10-45
• 1.1 引言10-11
• 1.2 DNA结合蛋白在稻瘟菌生长发育和致病性中的作用11-19
• 1.3 APSES类转录因子的研究19-29
• 1.4 PC4类DNA结合蛋白的研究进展29-38
• 1.5 结构生物方法简介38-44
• 1.6 本研究的研究内容及意义44-45
• 第二章 实验材料与方法45-62
• 2.1 实验材料45-49
• 2.2 常用溶液及培养基的配制49-52
• 2.3 实验方法52-62
• 第三章 Pcg2 DBD聚集状态及磷酸化作用对其DNA结合活性影响的分析62-75
• 3.1 Pcg2~(1-138)-MCB DNA复合物溶液状态的分析62-63
• 3.2 Pcg2~(1-138)Q82C突变体DNA复合物的晶体结构63-70
• 3.3 Pcg2~(1-138)S123E模拟磷酸化突变体DNA结合活性的研究70-73
• 3.4 实验结果的分析与讨论73-75
• 第四章 残基Y74、磷酸化作用及磷酸根离子对MoSub1 ssDNA结合活性的影响75-102
• 4.1 MoSub1与PC4 DNA结合模式区别的研究75-85
• 4.2 磷酸化作用对MoSub1 DNA结合活性的影响85-92
• 4.3 磷酸根离子对MoSub1 DNA结合活性的影响92-96
• 4.4 实验结果的分析与讨论96-102
• 第五章 总结与展望102-103
• 参考文献103-118
• 致谢118-120
• 附录120-122
• 作者简历122

  本文关键词：稻瘟病菌DNA结合蛋白Pcg2和MoSub1 DNA结合活性的结构基础，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：463591