甘蓝型油菜磷高效的蛋白组学与比较基因组学研究

发布时间：2017-06-20 20:13

  本文关键词：甘蓝型油菜磷高效的蛋白组学与比较基因组学研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：由于磷在土壤中的低溶解度和难移动性,使得其成为研究最广的植物大量矿质营养元素。油菜是我国重要的油料作物,其中甘蓝型油菜占我国油菜种植面积的80%以上。甘蓝型油菜需磷较多,对缺磷敏感,其栽培区又位于我国土壤磷缺乏或严重缺乏的地区。因此,研究甘蓝型油菜适应低磷胁迫的机制和磷营养高效的遗传机理,对于甘蓝型油菜磷吸收利用的遗传改良和栽培调控,以提高磷肥利用率,具有重要的理论和实践意义。本研究以课题组前期筛选出的磷高效基因型“鄂油长荚(Eyou Changjia)”和磷低效基因型“B104-2”为材料,应用双向电泳的蛋白质组学技术和基质辅助激光解析飞行时间质谱技术,分离鉴定两基因型根系、叶片中响应长期低磷胁迫和短期无磷饥饿下的差异蛋白;同时,应用Label-free技术对短期无磷饥饿下两基因型根系质膜蛋白进行定量与鉴定,获得一批响应磷饥饿的差异质膜蛋白。在此基础上,结合比较基因组学的方法,以课题组前期构建的甘蓝型油菜磷高效遗传连锁图谱为参考图谱,将差异蛋白定位到遗传连锁图上,建立差异蛋白与磷高效相关QTLs的联系,解析甘蓝型油菜磷胁迫的生理适应和耐受机制。获得的主要研究结果如下:1、长期低磷胁迫下的蛋白质组学分析以正常磷(200μM P)培养为对照,植株幼苗低磷(5μM P)胁迫18 d,然后转为正常磷培养培养2 d及5 d,取不同时间点根系和叶片样品,提取总蛋白进行蛋白组学分析。设有四个分析组,共分离鉴定到84个蛋白丰度发生显著改变的蛋白质点,其中分析组A(“B104-2”根系蛋白)19个、分析组B(“Eyou Changjia”根系蛋白)24个、分析组C(“B104-2”叶片蛋白)20个、分析组D(“Eyou Changjia”叶片蛋白)21个。2、短期无磷饥饿下的蛋白质组学分析以正常磷(200μM P)培养为对照,植株幼苗先在正常磷(200μM P)培养15d,然后转到无磷(0μM P)营养液中饥饿培养,分别在饥饿1 d、3 d和5 d时取根系和叶片样品,提取总蛋白进行蛋白组学分析。设有四个分析组,共分离鉴定了75个蛋白丰度发生显著改变的蛋白,其中分析组E(“B104-2”根系蛋白)16个、分析组F(“Eyou Changjia”根系蛋白)24个、分析组G(“B104-2”叶片蛋白)17个、分析组H(“Eyou Changjia”叶片蛋白)18个。3、两基因型中差异蛋白的功能分析磷缺乏下两基因型中发生差异的蛋白主要涉及防御与胁迫反应、碳水化合物与能量代谢、信号转导与调控、氨基酸及脂肪酸代谢、蛋白过程、细胞结构组分和功能未知蛋白。磷缺乏时8个分析组中防御与胁迫反应的差异蛋白有43个,其中76.7%为上调蛋白,主要与抗氧化相关。与磷低效基因型“B104-2”相比,磷高效基因型“Eyou Changjia”能更有效的抑制超氧阴离子(O2·-)的产生,降低膜脂过氧化水平。因此较强的抗氧化能力是甘蓝型油菜磷高效的机制之一。磷缺乏使得磷高效基因型中硫脂合蛋白sqd1上调以增加硫脂的合成替换细胞中的磷脂,为磷缺乏的细胞提供更多的磷。因而,细胞的膜脂重构为甘蓝型油菜磷高效的又一机制。磷缺乏也改变了两基因型中的碳水化合物代谢,参与此过程的差异蛋白有37个。磷缺乏下,磷高效基因型“Eyou Changjia”诱导形成胞质UDP-葡萄糖旁路代谢途径以绕开糖酵解途径中ATP和无机磷消耗大的途径。4、质膜纯化体系的建立与质膜蛋白质组学浅析通过比较分析5.8%-6.4%浓度下的葡聚糖-聚乙二醇两相分配体系对甘蓝型油菜根系质膜纯化的影响,建立了根系质膜纯化的技术体系:采用6.2%葡聚糖-聚乙二醇两相体系可得到高纯度(大约90%)且蛋白产量较高(大约6.5μg/g FW)的质膜组分。使用该技术体系纯化质膜后,采用label-free法进行质膜蛋白组学研究,共分离鉴定了71个差异质膜蛋白,磷高效基因型“Eyou Changjia”31个,磷低效基因型“B104-2”40个。按质膜蛋白的功能及参与的生化过程将质膜蛋白分为细胞骨架、细胞防御、转运蛋白、信号转导、蛋白修饰、蛋白合成与降解、代谢与能量转化、功能未知蛋白。5、比较基因组学方法建立差异蛋白与QTLs的联系利用比较基因组学的方法,将总蛋白中94个差异蛋白及35个质膜差异蛋白成功定位到遗传连锁图谱上,其中72个差异蛋白和30个质膜差异蛋白定位于磷效率系数、磷含量、干物质重等磷高效相关的QTLs置信区间内,建立了差异蛋白与QTLs之间的联系,为分离克隆QTLs区间内的基因提供基因信息。
【关键词】：甘蓝型油菜 磷高效 蛋白质组学 比较基因组学 生理分子机制
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S565.4
【目录】：

• 中文摘要9-11
• ABSTRACT11-14
• 缩略语表14-15
• 1 文献综述15-31
• 1.1 土壤磷分布状况与利用现状15-16
• 1.2 植物磷营养及其生理功能16-18
• 1.3 植物适应低磷胁迫的机制18-22
• 1.3.1 形态学适应18-19
• 1.3.2 根系分泌物对土壤磷的活化19-21
• 1.3.3 植物体内磷的再利用21
• 1.3.4 植物适应低磷胁迫的分子机理21-22
• 1.4 植物蛋白组学研究现状22-29
• 1.4.1 蛋白质组学概念及其发展22-23
• 1.4.2 蛋白质组学相关研究技术23-26
• 1.4.3 国内外植物蛋白质组学研究现状26-28
• 1.4.4 甘蓝型油菜蛋白质组学研究现状28-29
• 1.5 比较基因组学研究进展29-31
• 2. 研究的意义、目的和内容31-34
• 2.1 研究意义31
• 2.2 研究目的31-32
• 2.3 研究内容32-33
• 2.4 技术路线33-34
• 3. 长期低磷胁迫下可溶性总蛋白的分离鉴定34-56
• 3.1 材料与方法34-39
• 3.1.1 试验材料培养34
• 3.1.2 生物量及磷含量测定34-35
• 3.1.3 可溶性总蛋白的抽提与定量35-36
• 3.1.4 蛋白质双向电泳36-37
• 3.1.5 凝胶胶图染色与图像分析37-38
• 3.1.6 差异蛋白质点切取与酶解38
• 3.1.7 质谱分析与数据库检索38-39
• 3.2 结果与分析39-55
• 3.2.1 长期低磷胁迫对生物量及磷相关性状的影响39-42
• 3.2.2 长期低磷胁迫下的双向电泳图谱分析42-44
• 3.2.3 长期低磷胁迫下差异蛋白质谱鉴定44-55
• 3.3 讨论55-56
• 4. 短期无磷饥饿下可溶性总蛋白的分离鉴定56-73
• 4.1 材料与方法56-57
• 4.1.1 试验材料培养56
• 4.1.2 生物量及磷含量测定56
• 4.1.3 可溶性总蛋白的抽提与定量56-57
• 4.1.4 蛋白质双向电泳57
• 4.1.5 凝胶胶图染色与图像分析57
• 4.1.6 差异蛋白质点切取与酶解57
• 4.1.7 质谱分析与数据库检索57
• 4.2 结果与分析57-72
• 4.2.1 短期无磷饥饿对生物量及磷相关性状的影响57-61
• 4.2.2 短期无磷饥饿下的双向电泳图谱分析61-62
• 4.2.3 短期无磷饥饿下差异蛋白质谱鉴定62-72
• 4.3 讨论72-73
• 5. 磷缺乏诱导的差异蛋白功能分析73-80
• 5.1 材料与方法73
• 5.1.1 试验材料73
• 5.1.2 功能注释与代谢图谱构建73
• 5.2 结果分析与讨论73-80
• 5.2.1 不同磷效率基因型间差异蛋白的比较73-76
• 5.2.2 碳水化合物及能量代谢76-78
• 5.2.3 抗逆与防御反应相关蛋白78-79
• 5.2.4 氨基酸及脂肪酸代谢、蛋白翻译与降解79-80
• 6. 磷胁迫下抗氧化反应的差异分析80-92
• 6.1 材料与方法80-83
• 6.1.1 试验材料80
• 6.1.2 试验设计80
• 6.1.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定80-81
• 6.1.4 过氧化氢酶（CAT）活性测定81
• 6.1.5 抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定81
• 6.1.6 愈创木酚过氧化物酶（GPX）活性测定81
• 6.1.7 谷胱甘肽还原酶（GR）活性测定81-82
• 6.1.8 膜脂过氧化分析82
• 6.1.9 超氧阴离子（O_2）及过氧化氢（H_2O_2）测定82-83
• 6.2 结果与分析83-89
• 6.2.1 不同磷处理对根系和叶片的膜脂过氧化的影响83-84
• 6.2.2 不同磷处理对根系及叶片中O_2和H_2O_2 的影响84-85
• 6.2.3 短期无磷饥饿对抗氧化酶活性的影响85-87
• 6.2.4 长期低磷胁迫对抗氧化酶活性的影响87-89
• 6.4 讨论89-92
• 7. 短期无磷饥饿处理下根系质膜蛋白质组学浅析92-112
• 7.1 材料与方法92-98
• 7.1.1 试验材料培养92
• 7.1.2 生物量及磷含量测定92-93
• 7.1.3 伤流的测定93
• 7.1.4 质膜的分离93-96
• 7.1.5 质膜纯度的检测96-97
• 7.1.6 质膜蛋白的提取与label-free鉴定97-98
• 7.2 结果与分析98-110
• 7.2.1 短期无磷饥饿下的生理性状分析98-100
• 7.2.2 短期无磷饥饿下伤流液分析100-101
• 7.2.3 质膜分离体系的优化101-103
• 7.2.4 质膜蛋白的分析103-110
• 7.3 讨论110-112
• 8. 差异蛋白的图谱定位112-127
• 8.1 材料与方法112-113
• 8.1.1 试验材料112
• 8.1.2 比较基因组学作图112-113
• 8.2 结果与分析113-125
• 8.2.1 2-DE 检测的差异蛋白在遗传图谱上的定位113
• 8.2.2 Label-free检测的差异蛋白在遗传图谱上的定位113-125
• 8.3 讨论125-127
• 9.候选基因的表达分析127-133
• 9.1 材料与方法127-130
• 9.1.1 试验材料127-128
• 9.1.2 RNA的提取及测定128-129
• 9.1.3 引物设计及q PCR129-130
• 9.1.4 数据分析130
• 9.2 结果与分析130-132
• 9.3 讨论132-133
• 10.研究总结与展望133-136
• 10.1 研究总结133-134
• 10.2 本研究的主要创新点134-135
• 10.3 本研究不足之处135
• 10.4 研究展望135-136
• 参考文献136-157
• 致谢157-158
• 作者简介158
• 在读期间发表论文158-159
• 会议摘要159-160

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 陈屏昭,樊钦平,罗家刚,刘忠荣,王磊,陈顺方;缺磷胁迫对脐橙光合色素和光合作用的影响[J];广东微量元素科学;2002年12期

2 龙晓辉;莫志宏;张耀洲;;基于二维凝胶电泳的蛋白质定量分析技术[J];化学进展;2006年04期

3 王振华;王志方;陈水森;徐芳森;石磊;;甘蓝型油菜根系可溶性蛋白的提取及双向电泳体系的优化[J];华中农业大学学报;2011年02期

4 尹逊霄,华珞,张振贤,滑丽萍,高娟;土壤中磷素的有效性及其循环转化机制研究[J];首都师范大学学报(自然科学版);2005年03期

5 明凤,米国华,张福锁,郑先武,朱立煌;水稻对低磷反应的基因型差异及其生理适应机制的初步研究[J];应用与环境生物学报;2000年02期

6 刘国顺;肖庆礼;王艳丽;;不同供磷能力的土壤施磷对烤烟根体积和根冠比以及根系伤流组分的影响[J];中国烟草学报;2009年02期

7 段海燕,徐芳森,王运华;甘蓝型油菜不同品种磷运转和再利用差异的研究[J];中国油料作物学报;2002年04期

8 严小龙,廖红,戈振扬,罗锡文;植物根构型特性与磷吸收效率[J];植物学通报;2000年06期

9 李媛媛;傅廷栋;马朝芝;;芸薹属植物比较基因组学研究进展[J];植物学通报;2007年02期

10 段海燕,徐芳森,王运华;甘蓝型油菜不同磷效率品种苗期根系生长及磷营养的差异[J];植物营养与肥料学报;2002年01期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 杨美;甘蓝型油菜根系形态对低磷胁迫的反应及其QTL分析[D];华中农业大学;2010年

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 黄宇;甘蓝型油菜酸性磷酸酶与磷营养关系的研究[D];华中农业大学;2007年

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