黄瓜耐冷生理变化规律及相关基因转录组测序和表达分析

发布时间：2017-06-22 08:00

  本文关键词：黄瓜耐冷生理变化规律及相关基因转录组测序和表达分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：温度是植物自然地理分布和产量形成的主要限制因素,同时也是作物生长发育的必要条件之一。黄瓜(Cucumis sativus.L.)属喜温作物,对温度反应敏感,耐寒力弱,是我国设施栽培及露地生产中重要的蔬菜种类之一。但是在实际的农业生产中,经常会发生低温冷害,导致农作物减产,给广大农户造成巨大的经济损失,是农业生产中及极其严重的自然灾害,在黑龙江省低温冷害现象表现的更为突出。本研究以黄瓜幼苗为试材,以6℃为低温胁迫条件,采用冷害指数调查、生理生化指标的测定、转录组测序、差异基因GO分析、pathway分析、实时荧光定量PCR及RNAi等技术试图从生理和分子水平研究植物的低温胁迫反应的生理机制,旨在为提高黄瓜的耐冷栽培、促进植物耐冷基因工程的进展、通过分子手段研究植物关键基因的调控及提高耐冷性奠定基础,同时也为黄瓜育种和耐冷栽培提供一定的生理生化和分子理论基础。通过冷害指数调查对搜集的20个黄瓜自交系进行耐冷性鉴定,获得耐冷自交系6个,冷敏自交系5个,耐冷中间型自交系9个。明确黄瓜的耐冷性与黄瓜品种的类型无明显关系。低温胁迫后黄瓜的生理生化代谢发生变化,相对电导率、渗透调节物质可溶性糖、可溶性蛋白,脯氨酸、丙二醛的含量升高,叶绿素含量降低,超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶的活性增强。以冷害指数为依据,确定了黄瓜耐冷相关生理生化指标。相对电导率增量可以作为耐冷指标,14.36以下的可认定为耐冷型黄瓜,25.67以上的可认定为冷敏型黄瓜。丙二醛含量增量和增幅都可以作为耐冷指标,4.17、166.14%以下的可认定为耐冷型黄瓜,5.98、223.97%以上的可认定为冷敏型黄瓜。脯氨酸含量增量可以作为耐冷指标,54.00以上的可认定为耐冷型黄瓜,45.00以下的可认定为冷敏型黄瓜。可溶性糖含量增量可以作为耐冷指标,1.09以上的可认定为耐冷型黄瓜,0.63以下的可认定为冷敏型黄瓜。可溶性蛋白含量增量可以作为耐冷指标,20.38以上的可认定为耐冷型黄瓜,14.90以下的可认定为冷敏型黄瓜。叶绿素含量降量和降幅都可以作为耐冷指标,0.48、36.36%以下的可认定为耐冷型黄瓜,0.87、69.23%以上的可认定为冷敏型黄瓜。超氧化物歧化酶活性增量和增幅都可以作为耐冷指标,21.56、141.75%以上的可认定为耐冷型黄瓜,13.92、59.05%以下的可认定为冷敏型黄瓜。过氧化物酶活性增量和增幅都可以作为耐冷指标,73、73.74%以上的可认定为耐冷型黄瓜,16、16.84%以下的可认定为冷敏型黄瓜。过氧化氢酶活性增量可以作为耐冷指标,12.85以上的可认定为耐冷型黄瓜,9.66以下的可认定为冷敏型黄瓜。同时获得生理生化指标的相关性,冷害指数与相对电导率和丙二醛含量呈显著性正相关,与脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、叶绿素含量、SOD活性、POD活性和CAT活性呈显著性负相关。以鉴定获得的耐冷型黄瓜自交系A和冷敏型黄瓜自交系D及经过6℃低温处理后的A1、D1为材料,通过转录组测序,材料A获得14302个基因,材料A1获得15032个基因,材料D获得14843个基因,材料D1获得14993个基因。通过差异基因比对获得A-VS-A1的上调表达基因3353个、下调表达基因1629个,D-VS-D1的上调表达基因886个、下调表达基因262个。材料A发现了1300个新转录本,材料A1发现了1253个新转录本,材料D发现了1264个新转录本,材料D1发现了1213个新转录本。从实验材料获得了可变剪接,材料A的可变剪接数为43716个、材料A1为49134个、材料D为38223个、材料D1为48501个。通过一致性序列与参考序列的比较,从而找到SNPs,材料A为36539、A1为37004、D为32967、D1为39189。通过GO功能显著性富集分析确定在A-VS-A1 Cellular component中,最富集的是non-membrane-bounded organelle,共有288个基因;molecular function中最富集的是hydrolase activity,共有107个基因;biological process中最富集的是DNA replication initiation,共有20个基因。在D-VS-D1 Cellular component中,最富集的是external encapsulating structure,共有20个基因;molecular function中最富集的是oxidoreductase activity,共有8个基因;biological process中最富集的是response to chemical,共有133个基因。同时在耐冷材料中发现了376个在冷敏材料中无差异表达的基因,其中上调表达基因167个、下调表达基因209个。通过对代谢通路分析,在植物激素信号转导通路中,耐冷材料有278个差异表达基因,冷敏材料有83个差异表达基因。在植物病原菌互作通路中,耐冷材料有241个差异表达基因,冷敏材料有58个差异基因。在卟啉和叶绿素代谢通路中,耐冷材料有17个差异表达基因,冷敏材料有3个差异基因。在过氧化物酶体代谢通路中,耐冷材料有20个差异表达基因,冷敏材料有2个差异基因。在脂肪酸代谢通路中,耐冷材料有6个差异表达基因,冷敏材料没有这个代谢通路。在光合作用代谢通路中,耐冷材料有7个差异表达基因,冷敏材料没有差异基因表达。在精氨酸和脯氨酸代谢通路中,耐冷材料有28个差异表达基因,冷敏材料有4个差异基因。在自噬调节代谢通路中,耐冷材料有15个差异表达基因,冷敏材料有9个差异基因。而且把差异表达基因都定位在了蛋白和酶处,并获得了所有差异表达基因的全长序列。通过对上调表达基因Cucsa.038100.1和下调表达Cucsa.178120.1的实时荧光定量PCR,确定在A材料中基因Cucsa.038100.1表达最好,处理前表达量比较高,处理后开始降低再升高,在处理4小时最高,然后降低再升高。基因Cucsa.178120.1处理前在材料D中表达最好,然后降低再升高,但是在处理4小时在A材料中最高,然后降低再升高,在12小时达到另一个峰值。通过比对分析明确上调表达基因起主要作用。
【关键词】：黄瓜 生理生化指标 转录组测序 代谢通路分析 表达分析
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S642.2
【目录】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-13
• 1 前言13-31
• 1.1 研究的目的和意义13-14
• 1.2 研究内容和技术路线14-15
• 1.2.1 研究内容14-15
• 1.2.2 研究技术路线15
• 1.3 国内外研究动态与趋势15-31
• 1.3.1 植物的表达系统和耐冷性16-22
• 1.3.2 植物耐冷基因的研究进展22-24
• 1.3.3 转录组测序24-26
• 1.3.4 实时荧光定量PCR26-27
• 1.3.5 比较基因组学27
• 1.3.6 RNA干扰技术的研究进展27-31
• 2 材料与方法31-41
• 2.1 黄瓜自交系的收集及耐冷性鉴定31-33
• 2.1.1 试验材料31
• 2.1.2 试验方法31-33
• 2.2 不同黄瓜自交系低温处理后转录组文库制备33-37
• 2.2.1 试验材料33-34
• 2.2.2 试验方法34-37
• 2.3 黄瓜基因组中耐冷相关基因组织表达特异性分析37-40
• 2.3.1 试验材料37
• 2.3.2 处理方法37
• 2.3.3 主要仪器设备37-38
• 2.3.4 PCR引物设计与合成38
• 2.3.5 总RNA的提取38
• 2.3.6 c DNA链合成38
• 2.3.7 反转录38-39
• 2.3.8 荧光定量PCR39-40
• 2.4 利用RNAi验证候选基因在黄瓜耐冷中的功能40
• 2.4.1 ds RNA干扰载体的构建40
• 2.5 数据统计分析40-41
• 3 结果与分析41-89
• 3.1 黄瓜自交系耐冷性鉴定41-52
• 3.1.1 利用冷害指数调查的方法对黄瓜自交系的耐冷性鉴定41
• 3.1.2 不同耐冷性黄瓜自交系的生理生化指标变化规律41-52
• 3.2 不同黄瓜自交系低温处理后基因表达谱差异分析52-86
• 3.2.1 Solexa测序结果评估52-57
• 3.2.2 获得的测序结果与分析57-86
• 3.3 黄瓜基因组中耐冷基因组织表达特异性分析86-89
• 3.3.1 荧光定量PCR曲线86-87
• 3.3.2 特异性表达分析87-89
• 4 讨论89-94
• 4.1 黄瓜冷害与鉴定方法89-90
• 4.2 基因克隆技术与转录组测序90-91
• 4.3 黄瓜基因功能验证与生理生化指标91
• 4.4 黄瓜低温处理后代谢通路和冷害调控的关系91-92
• 4.5 耐冷相关基因的表达92-93
• 4.6 本论文的创新之处93
• 4.7 下一步工作设想93-94
• 5 结论94-96
• 致谢96-97
• 参考文献97-116
• 附录116-127
• 攻读博士学位期间发表的学术论文127

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 马丽;张春庆;;RNA干扰机制及应用研究进展[J];北方园艺;2012年10期

2 康俊梅;李燕;沈静;熊军波;杨青川;;低温胁迫对野牛草幼苗渗透调节物与根系活力的影响[J];中国畜牧兽医;2010年12期

3 杨帆;黄立华;张爱兵;;高通量转录组测序技术及其在鳞翅目昆虫上的应用[J];昆虫学报;2014年08期

4 冷鹂;Q美

本文编号：471095