乌桕花芽转录组测序分析及花发育调控机制研究

发布时间：2017-07-05 20:17

  本文关键词：乌桕花芽转录组测序分析及花发育调控机制研究

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【摘要】：乌桕属大戟科落叶乔木,为中国特有的经济树种,已有1400多年的栽培历史。兼具药用、观赏、工业油料等用途,经济价值高。但乌桕幼年期较长,许多性状要在成年期才表现出来,很大程度上限制了乌桕遗传育种及其相关研究工作进展。因此,促进乌桕提早开花,缩短其幼年期,对加速该树种的遗传改良周期具有积极作用。论文首次对乌桕花器官发育进程进行解剖观测,利用illumina技术平台对乌桕花芽进行高通量转录组测序,对花发育过程中相关关键基因和代谢调控通路进行生物信息学分析；然后利用测序信息克隆了乌桕开花相关基因SsLFY和MADS-box (SsAP1、SsTFL、SsAP2、SsCO、SsFUL)等关键基因；同时在转录水平和蛋白水平对环境胁迫诱导的乌桕早花材料进行了分析；并建立了乌桕功能基因VIGS鉴定体系,获得了一系列开创性的研究结果。丰富了乌桕花发育的生物学理论,为进一步研究乌桕开花调控机制和开发利用提供了重要的科学依据。本研究的主要结论如下：1.乌桕花发育解剖学研究采用石蜡切片法对乌桕花发育显微结构进行观察,根据显微结构特征将乌桕花的形态分化划分为5个时期：花序原基分化期、雄花小花原基分化期、雄花花粉分化期及雌花原基分化期、雄花花粉成熟及雌蕊分化期、雌花子房形成期。根据形态观察对乌桕花发育阶段进行了重新划分,分成6个阶段：花序芽膨大、花序出现、花序继续伸长、雄花部分开放同时底部雌花芽膨大、雄花完全开放伴随雌花芽出现、雌花完全开放。2.乌桕花芽转录组测序分析应用HiSeq2500平台对乌桕花芽进行转录组测序,测序数据共产生碱基数约合6.47G,总共进行了64,663,388次读数,总共产生149,342条Unigene,平均长度为635bp,其中长度在1kb以Unigenes有67,577条,占Unigene库总数的45.25%。对样本转录组测序数据进行了GO注释分类和KEGG代谢通路分析,获得Unigenes的注释信息,总注释的Unigenes为129,434个。在所有的Unigene中,有70个基因的FPKM值超过6000,表明在花序中高表达。借助隐式马尔可夫模型对乌桕MADS box基因进行了鉴定并构建了系统发育树,乌桕的MADS box可以整合到拟南芥的MADS box进化枝中,发现乌桕中有24个基因可确认为Ⅱ型(MIKC) MADS-box基因,其余14个可分别归类到Mα、 Mγ、Mδ和AGL33类型的MADS-box基因中。然后对乌桕花发育调控通路、脂肪酸合成代谢通路、环境胁迫基因调控网络进行了预测。3.乌桕花发育相关基因的克目前,基于模式植物拟南芥花发育关键基因的研究结果,木本植物中,如柑橘、葡萄、杨树、苹果、核桃等很多开花调控基因也已被分离出来,但Genbank上未见乌桕花发育基因的序列,更没有对其功能和表达特性研究的报道。本文以葡萄桕为材料,借助乌桕花转录组数据筛选出花发育的候选基因,利用RACE技术克隆并验证筛选出的候选基因序列(如TFL1、LFY、API、CO、AP2、FUL等),利用半定量RT-PCR分析这些基因的组织特异性表达情况,并对其功能进行初步的鉴定分析,为研究乌桕花发育分子机理以及植物的花期调控奠定基础。4.乌桕功能基因VIGS鉴定体系的建立随着人们对病毒诱导的基因沉默现象的不断研究,VIGS逐渐成为人们用来研究植物基因功能的反向遗传学手段,提供了一个快速便捷的鉴定目标基因功能的方法。本文以不同指示基因SsPDS和SsAS1为研究对象,通过插入不同区段的SsPDS基因片段(5'和3'端)和不同长度的SsAS1基因片段(493bp和323bp),构建pTRV病毒表达载体,通过注射的方式将带有TRV2-SsPDS的农杆菌GV3101菌液导入乌桕叶片,三周后可观察到乌桕顶端新生叶片出现光漂白,五周后光漂白现象更加明显。同时采用半定量RT-PCR比较不同长度片段和区段对病毒积累量和沉默效率之间的关系。结果显示,被侵染的乌桕表现出明显的光漂白现象,半定量RT-PCR分析表明,与对照相比,SsPDS基因的mRNA被显著降解。以构建病毒载体pTRV-SsAS1,侵染乌桕叶片验证建立的TRV-VIGS技术体系。结果表明,被侵染的乌桕表现出明显的叶片不规则皱缩现象,半定量RT-PCR结果发现侵染的乌桕中SsAS1基因的mRNA被显著降解。成功建立了利用TRV-VIGS载体的高效乌桕基因沉默体系建立乌桕的VIGS技术体系,为乌桕花发育基因的功能鉴定提供快速可行的实验体系。5.胁迫诱导乌桕早花的分析干旱、高盐、低温、高光强等逆境条件下,植物通过改变生理过程而减少逆境对细胞的伤害,同时会提前开花以尽早完成其生命周期,该生物学现象被称为“逆境诱导的开花”。本章通过在温室内模拟盆栽实验,探索了高温和干旱协同胁迫诱导乌桕幼苗早花的条件,并从转录和蛋白组水平分析了相关转录因子对逆境胁迫的响应的差异。研究发现,模拟高温十旱处理乌桕三个月左右,处理组的20株一年生乌桕幼苗中有4株出现了肉眼可见的花芽。半定量RT-PCR技术对乌桕转录组数据中花发育关键基因进行了分析。显示一年生和两年生乌桕中花发育相关基因AG、GA1、SPY、SOC1、AP2、AP3、VRN2、RIP、CRY2等在早花组和对照组中的表达均有不同差异,同时GRX50435、GRX29400、CAT97419、SOD28463, PRXII25514、PRXII39562、PRX25913氧化还原调节相关基因和SEBIN的表达量均有很大提高,我们推测CAT、PRX、GRX和SOD在干旱胁迫诱导的乌桕早花过程发挥了重要的调控作用。此外,借助双向电泳技术分离了乌桕植株的总蛋白进行比较蛋白质组学分析,在41个差异表达的蛋白中,选取25个相对丰度较高的蛋白用MALDI-TOF/TOF质谱进行了鉴定,10个蛋白得到了成功鉴定。在这些蛋白中,主要是一些与物质及能量代谢、光合作用、氧化胁迫反应、逆境响应相关蛋白。其中3个蛋白为参与糖代谢的酶,包括果糖二磷酸醛缩酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶和磷酸核酮糖激酶,主要是为了增加碳水化合物的合成。其余7个蛋白分别是放氧增强蛋白1、光体系Ⅰ亚基Ⅶ、脱落酸胁迫催熟类蛋白、渗调蛋白、S-腺苷高半胱氨酸核苷酶、抗坏血酸过氧化物酶和过氧化物酶,主要参与其它生理过程。这些蛋白的产生能提高植物细胞渗透势,对维持脱水状态下的细胞稳态是非常必要的。本论文对乌桕花发育相关生物学特性进行了系统研究,并建立了相关乌桕VIGS功能基因鉴定体系,同时还对胁迫诱导乌桕早花进行了探索,分别在转录组和蛋白组水平对相关基因和蛋白进行了分析,对于乌桕的遗传育种及其相关研究具有重要的科学意义和应用前景。
【关键词】：能源植物 乌桕 花发育 转录组测序 花发育关键基因 胁迫诱导早花 VIGS
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S792.99
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-14
• 第1章 绪论14-26
• 1.1 引言14-15
• 1.2 乌桕应用价值及生物学特性15-20
• 1.2.1 应用价值15-18
• 1.2.2 生物学特性18-20
• 1.3 植物花发育的研究进展20-24
• 1.3.1 高等植物的成花过程20-21
• 1.3.2 花发育相关基因的研究进展21-23
• 1.3.3 环境因子对花发育的调控23-24
• 1.4 主要研究内容及技术路线24-26
• 第2章 乌桕花发育形态学研究及其转录组测序分析26-46
• 2.1 引言26
• 2.2 实验材料与方法26-29
• 2.2.1 材料26-27
• 2.2.2 试剂27
• 2.2.3 主要仪器设备27
• 2.2.4 乌桕花芽石蜡制片方法27-28
• 2.2.5 总RNA的提取及纯化28
• 2.2.6 乌桕花芽转录组Illumina高通量测序及分析28-29
• 2.3 结果29-46
• 2.3.1 乌桕花芽分化的显微结构观察30-32
• 2.3.2 乌桕花发育过程的形态学观察32-33
• 2.3.3 RNA提取33-34
• 2.3.4 原始测序数据统计34-35
• 2.3.5 Unigenes功能注释35-36
• 2.3.6 GO和KEGG富集分析36-37
• 2.3.7 MADS box基因鉴定及系统发育树构建37-39
• 2.3.8 乌桕花发育调控通路的预测39-42
• 2.3.9 乌桕脂肪酸合成代谢通路的预测42-43
• 2.3.10 乌桕环境胁迫基因调控网络的预测43-46
• 第3章 乌桕花发育关键基因研究46-84
• 3.1 引言46
• 3.2 实验材料与方法46-53
• 3.2.1 植物材料46
• 3.2.2 主要试剂46-47
• 3.2.3 实验方法47-53
• 3.3 结果53-82
• 3.3.1 乌桕SsLFY基因的克隆及功能分析53-63
• 3.3.2 乌桕SsTFL1基因的克隆及功能分析63-67
• 3.3.3 乌桕SsAP1基因的克隆及序列分析67-71
• 3.3.4 乌桕SsAP2基因的克隆及序列分析71-75
• 3.3.5 乌桕SsCO基因的克隆及序列分析75-79
• 3.3.6 乌桕SsFUL基因的克隆及序列分析79-82
• 3.4 小结82-84
• 第4章 乌桕VIGS功能基因鉴定体系的建立84-98
• 4.1 引言84
• 4.2 实验材料与方法84-88
• 4.2.1 实验材料84-85
• 4.2.2 质粒与菌种85
• 4.2.3 实验仪器85
• 4.2.4 试剂85
• 4.2.5 实验方法85-88
• 4.3 结果88-95
• 4.3.1 乌桕PDS和AS1同源基因的克隆88
• 4.3.2 乌桕PDS和AS1同源基因的克隆88-89
• 4.3.3 VIGS病毒载体的构建89-90
• 4.3.4 乌桕PDS基因VIGS实验体系的建立90-94
• 4.3.5 乌桕AS1基因验证VIGS体系94-95
• 4.4 小结95-98
• 第5章 干旱胁迫诱导乌桕早花研究98-114
• 5.1 引言98-99
• 5.2 实验材料与方法99-103
• 5.2.1 试剂99
• 5.2.2 实验仪器99
• 5.2.3 溶液配制99
• 5.2.4 实验方法99-103
• 5.3 结果103-110
• 5.3.1 干旱胁迫诱导的早花乌桕103-104
• 5.3.2 胁迫诱导的早花乌桕转录水平分析104-106
• 5.3.3 胁迫诱导的早花乌桕蛋白水平分析106-110
• 5.4 讨论110-114
• 结论114-116
• 参考文献116-126
• 附录126-148
• 致谢148-150
• 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果150-151

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