蓝舌病病毒1型DNA疫苗及重组禽痘病毒载体疫苗的研究

发布时间：2017-07-05 07:08

  本文关键词：蓝舌病病毒1型DNA疫苗及重组禽痘病毒载体疫苗的研究

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【摘要】：蓝舌病(Bluetongue,BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的一种反刍动物的虫媒传染病,主要感染绵羊、山羊、牛、鹿和骆驼等。根据BTV表面蛋白VP2抗原性不同,BTV目前至少可以分为27个不同血清型,在我国已经发现的血清型有BTV-1,2,3,4,12,15,16七个血清型,其中1型和16型是我国主要流行血清型。疫苗免疫是预防和控制蓝舌病最有效的方法。目前,市场上应用的蓝舌病病毒疫苗主要是弱毒苗及灭活苗,但这两种疫苗均存在一定的缺陷。灭活苗影响流行病学监测,弱毒苗可能会产生毒力残留及与流行野毒株发生基因重组。因此,研制新型的更为安全有效的疫苗对于蓝舌病的防控显得尤为重要。本研究分别构建了3种表达蓝舌病病毒1型(BTV-1)表面蛋白VP2、VP5及共表达(VP2+VP5)的重组禽痘病毒载体疫苗及重组DNA疫苗,分别命名为r FPV-VP2、r FPV-VP5、r FPV-(VP2+VP5)、p CAG-VP2、p CAG-VP5和p CAG-(VP2+VP5)。首先在BALB/c小鼠模型上对其免疫效果进行了系统评价。我们采取了3种不同的免疫策略:DNA疫苗首免及加免;r FPV疫苗首免及加免;DNA疫苗首免、r FPV疫苗加免。而每一种免疫策略中又包含了3种不同的免疫方式,即VP2单独免疫组、VP2和VP5联合免疫组以及共表达(VP2+VP5)组。结果表明,在3种免疫策略中,DNA疫苗首免、r FPV疫苗加免这一策略可以更好的诱导机体产生体液免疫及细胞免疫;而在每一种免疫策略中,共表达(VP2+VP5)免疫组的免疫效果均优于VP2单独免疫组或VP2和VP5联合免疫组。在所有免疫组中,用DNA疫苗p CAG-(VP2+VP5)首免、r FPV-(VP2+VP5)加免是最佳的免疫策略,可以诱导产生最高的中和抗体及最佳的细胞免疫反应。基于在小鼠实验上的结果,本研究进一步将DNA疫苗p CAG-(VP2+VP5)首免、r FPV-(VP2+VP5)加免这一免疫策略在蓝舌病本体动物绵羊上进行了系统的免疫评价。在绵羊上的研究结果表明,用p CAG-(VP2+VP5)首免、r FPV-(VP2+VP5)加免同样可以在蓝舌病本体动物绵羊上诱导产生高滴度的中和抗体及良好的细胞免疫反应。在加强免疫后2周,中和抗体滴度最高可达188.36,高于文献报道的BT重组金丝雀痘疫苗和VLP疫苗在绵羊上诱导产生的中和抗体滴度。BTV攻毒试验需要在生物安全三级实验室进行,由于试验条件的限制,目前还未进行下一步的攻毒试验。虽未进行攻毒保护的研究,但是据已有文献报道,BTV疫苗免疫保护效果与中和抗体滴度和细胞免疫反应有着密切的关系。本试验用DNA疫苗p CAG-(VP2+VP5)首免、重组禽痘病毒疫苗r FPV-(VP2+VP5)加免后能够产生高滴度的中和抗体和良好的细胞免疫反应,因此我们有理由推测用p CAG-(VP2+VP5)首免、r FPV-(VP2+VP5)加免这一免疫方式可以对绵羊提供良好的免疫保护。本研究构建的蓝舌病病毒1型DNA疫苗及重组禽痘病毒疫苗,在蓝舌病的防控方面显示了良好的应用前景。
【关键词】：蓝舌病病毒1型 DNA疫苗 重组禽痘病毒疫苗
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S855.3
【目录】：

• 附件3-5
• 摘要5-6
• Abstract6-13
• 英文缩略表13-14
• 第一章 绪论14-23
• 1.1 蓝舌病概述14
• 1.2 蓝舌病的历史和分布14-15
• 1.3 BTV基因组结构和功能15-17
• 1.4 BTV的复制过程17-18
• 1.5 BTV的致病机制18-19
• 1.6 BT的预防19
• 1.7 BT疫苗的研究进展19-21
• 1.7.1 减毒活疫苗19
• 1.7.2 灭活疫苗19-20
• 1.7.3 病毒样颗粒（VLP）20
• 1.7.4 重组活载体疫苗20-21
• 1.8 禽痘病毒的研究进展21
• 1.9 研究的目的和意义21-23
• 第二章 重组禽痘病毒载体的构建23-36
• 2.1 材料23-24
• 2.1.1 病毒株和细胞23
• 2.1.2 质粒载体23
• 2.1.3 抗体23
• 2.1.4 主要试剂23
• 2.1.5 试剂盒23-24
• 2.2 方法24-28
• 2.2.1 表达BTV1-VP5基因禽痘病毒转移载体的构建24
• 2.2.2 表达BTV1-VP2基因禽痘病毒转移载体的构建24
• 2.2.3 共表达BTV1-(VP2+VP5)基因禽痘病毒转移载体的构建24-25
• 2.2.4 转染用质粒的准备25-26
• 2.2.5 成纤维细胞的制备26
• 2.2.6 转染26-27
• 2.2.7 重组禽痘病毒的筛选和纯化27
• 2.2.8 重组禽痘病毒的鉴定27-28
• 2.3 结果28-34
• 2.3.1 表达BTV1-VP5基因禽痘病毒转移载体pSY681-gfp-gpt-VP5的鉴定结果28-29
• 2.3.2 表达BTV1-VP2基因禽痘病毒转移载体pSY681-gfp-gpt-VP2的鉴定结果29-30
• 2.3.3 共表达BTV1-(VP2+VP5) 基因禽痘病毒转移载体pSY681-gfp-gpt- (VP2+VP5)的鉴定结果30-31
• 2.3.4 重组禽痘病毒的筛选和纯化31
• 2.3.5 重组禽痘病毒的PCR鉴定31-32
• 2.3.6 rFPV的免疫荧光鉴定32
• 2.3.7 rFPV的western blot鉴定32-33
• 2.3.8 rFPV的生长曲线33-34
• 2.4 讨论34-36
• 第三章 重组DNA疫苗的构建36-42
• 3.1 材料36
• 3.1.1 细胞和抗体36
• 3.1.2 质粒和载体36
• 3.1.3 主要试剂36
• 3.2 方法36-38
• 3.2.1 重组DNA疫苗pCAG- VP5的构建36-37
• 3.2.2 重组DNA疫苗pCAG- VP2的构建37
• 3.2.3 重组DNA疫苗pCAG- (VP2+VP5)的构建37
• 3.2.4 重组DNA疫苗质粒在 293T中的表达37-38
• 3.2.5 间接免疫荧光试验38
• 3.3 结果38-40
• 3.3.1 重组DNA疫苗pCAG- VP5的酶切和PCR鉴定38
• 3.3.2 重组DNA疫苗pCAG- VP2的酶切和PCR鉴定38-39
• 3.3.3 重组DNA疫苗pCAG- (VP2+VP5)的酶切和PCR鉴定39-40
• 3.3.4 间接免疫荧光结果40
• 3.4 讨论40-42
• 第四章 DNA疫苗及禽痘病毒重组疫苗在小鼠上的免疫评估42-56
• 4.1 材料和方法42-46
• 4.1.1 病毒株和细胞42
• 4.1.2 质粒42
• 4.1.3 试剂42
• 4.1.4 实验动物42
• 4.1.5 重组禽痘病毒的扩大培养及PFU的测定42-43
• 4.1.6 DNA疫苗重组质粒的大量提取43
• 4.1.7 BTV1型SZ97/1 株病毒TCID50的测定43
• 4.1.8 真核表达重组VP2、VP5蛋白的扩大培养及纯化43-44
• 4.1.9 动物实验44
• 4.1.10 免疫后特异性抗体的检测44-45
• 4.1.11 中和试验45
• 4.1.12 淋巴细胞增值试验45-46
• 4.1.13 细胞因子的检测46
• 4.1.14 统计学分析46
• 4.2 结果46-54
• 4.2.1 重组禽痘病毒的扩大培养后PFU值46
• 4.2.2 BTV1型SZ97/1 株病毒TCID50的测定结果46-47
• 4.2.3 重组VP2、VP5蛋白的反应原性鉴定47
• 4.2.4 疫苗免疫后特异性抗体反应47-49
• 4.2.5 中和抗体滴度49
• 4.2.6 疫苗免疫后的淋巴细胞增殖反应49-51
• 4.2.7 疫苗免疫后的细胞因子水平51-54
• 4.3 讨论54-56
• 第五章 DNA疫苗及禽痘病毒重组疫苗在绵羊上的免疫评估56-62
• 5.1 材料和方法56-57
• 5.1.1 病毒株和细胞56
• 5.1.2 质粒56
• 5.1.3 试剂56
• 5.1.4 实验动物56
• 5.1.5 动物实验56-57
• 5.1.6 免疫后特异性抗体的检测57
• 5.1.7 中和试验57
• 5.1.8 血清中细胞因子的检测57
• 5.2 结果57-60
• 5.2.1 疫苗免疫后的特异性抗体的检测57-59
• 5.2.2 中和试验59
• 5.2.3 血清中细胞因子的检测59-60
• 5.3 讨论60-62
• 第六章 全文结论62-63
• 参考文献63-73
• 致谢73-74
• 作者简历74

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