IBV感染鸡肾脏和脾脏转录组学分析及鸡IFITM1抑制IBV和NDV复制机制的研究

发布时间：2017-07-06 03:14

  本文关键词：IBV感染鸡肾脏和脾脏转录组学分析及鸡IFITM1抑制IBV和NDV复制机制的研究

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【摘要】：鸡传染性支气管炎病毒(IBV)和新城疫病毒(NDV)是危害养禽业的重要病原,二者引起急性、高度传染性禽呼吸道疾病,威胁着养禽业的发展。本研究通过转录组学分析了IBV感染后宿主脾脏和肾脏中全基因的差异表达情况,借以尝试揭示IBV的致病机制和宿主的抗病毒机制。我们比较分析了IBV感染早期和晚期脾脏基因差异表达情况。结果表明脾脏作为重要免疫器官参与了宿主对IBV的免疫反应,在IBV感染早期激发的免疫反应要强于感染晚期,IBV感染晚期诱导的炎症反应要强于感染早期。在IBV感染致死鸡的肾脏中共有1777个差异表达基因;其中包括干扰素诱导跨膜蛋白1(IFITM1)在内的103个免疫和炎症相关基因显著差异表达这103个免疫和炎症相关基因能够组成一个以IL6,STAT1,MYD88,IRF1和NFKB2为中心的相互作用网络。提示这些基因可能在宿主抵抗IBV感染过程中发挥重要作用。对差异表达基因进行生物信息学分析,结果显示差异表达基因主要参与信号转导、细胞粘附、能量代谢、细胞因子通路、免疫反应、凋亡调节等生物进程。我们首次对IBV感染鸡的肾脏和脾脏进行转录组学分析,研究结果为进一步深入了解宿主的抗病毒机制和IBV的致病机制提供了素材。IFITM是一类重要的抗病毒因子,我们在进行转录组学分析时发现ch IFITM1(LOC422993)在IBV感染的肾脏中显著上调表达。人源和鼠源IFITM蛋白通过定位在细胞膜或细胞内体膜上限制SARS-Co V、流感病毒、登革热病毒、人类免疫缺陷病毒等多种病毒的侵入,但鸡源IFITM1(ch IFITM1)在病毒感染中的潜在作用尚未见报道。通过生物信息学分析发现Gen Bank中标注为IFITM3的基因(LOC422993)含有IFITM家族特有的CD225保守结构域,因此LOC422993属于IFITM家族;但LOC422993缺失YXX?氨基酸基序,YXX?氨基酸基序的缺失是人源、鼠源、猪源IFITM1蛋白的共性,因此我们认为LOC422993为鸡源IFITM1而非IFITM3。通过荧光定量RT-PCR检测ch IFITM1基因的体内外分布情况时发现该基因在各组织分布差别很大,肾脏、气管和肺脏在转录水平几乎检测不到ch IFITM 1的表达,只有个别鸡检测到低拷贝表达;脾脏、胸腺和腺胃的表达量也较低,而消化道、法氏囊、肝脏和胰腺的表达量较高。同时体外培养的DF1和LMH细胞在转录水平检测不到ch IFITM 1的表达;CEF细胞中有微弱表达,推测可能是在制备细胞过程中肠道等ch IFITM 1高表达组织未能完全去除所致。进一步研究发现在IBV感染致死鸡的靶器官气管和肾脏中ch IFITM1 m RNA显著上调表达,其中在肾脏中的上调倍数高于气管中的上调倍数,ch IFITM1在其它6株IBV分离毒株感染致死鸡肾脏组织中同样上调表达,证实不同IBV毒株的感染普遍诱导ch IFITM1上调表达;鉴于自然状态下气管和肾脏中几乎检测不到ch IFITM1的表达,因此ch IFITM1在IBV靶器官气管和肾脏中属于病毒诱导型表达。同为禽呼吸道病毒的NDV感染24h就能在气管中诱导ch IFITM1上调表达,说明ch IFITM1较早地参与了机体抗病毒反应。NDV感染致死鸡的肾脏、气管和腺胃中ch IFITM1同样显著上调表达,说明IBV和NDV在体内诱导ch IFITM1表达方面具有相似性。体外过表达ch IFITM1发现该蛋白显著抑制NDV的复制。为了进一步鉴定ch IFITM1发挥抗病毒作用的区域,我们通过生物信息学方法预测ch IFITM1具有N端和C两个膜外区,分别缺失N端35个氨基酸和C端7个氨基酸,发现ch IFITM1 C端虽仅有7个氨基酸,但C端的缺失使得ch IFITM1极大地丧失了抑制NDV复制的能力。我们通过激光共聚焦实验发现与人源IFITM1不同,ch IFITM1蛋白并没有定位于细胞外膜而是位于细胞浆中,但并没有与内体标志物LAMP1共定位。以往的观点认为IFITM蛋白通过定位在细胞膜或内体膜上阻止病毒侵入从而发挥抗病毒作用,鉴于ch IFITM1的独特定位情况,我们推测ch IFITM1可能与已报到的人源和鼠源IFITM蛋白不同,具有独特的抗病毒机制。我们尝试从蛋白相互作用角度探究ch IFITM1蛋白独特的抗病毒机制,Pull-down实验证实ch IFITM1能够与EIF5A1在体外相互作用,进一步研究发现EIF5A1同样具有抑制NDV复制的能力,二者相互作用的原理和抗病毒机制还有待于进一步揭示。本研究首次证实ch IFITM1蛋白具有抑制病毒复制的能力,发现ch IFITM1蛋白特有的抑制病毒复制机制。
【关键词】：鸡传染性支气管炎病毒 转录组学 新城疫病毒 干扰素诱导跨膜蛋白1
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.31
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-15
• 英文缩略表15-16
• 第一章 引言16-27
• 1.1 鸡传染性支气管炎概述16-18
• 1.1.1 鸡传染性支气管炎病原学及形态学16
• 1.1.2 鸡传染性支气管炎病毒基因组结构及其编码蛋白16-17
• 1.1.3 鸡传染性支气管炎病毒分子流行病学17-18
• 1.2 冠状病毒相关天然免疫研究进展18-22
• 1.2.1 冠状病毒概述18-19
• 1.2.2 宿主针对冠状病毒的天然免疫应答19-22
• 1.3 新城疫病毒致病机制研究进展22-24
• 1.3.1 新城疫概述22
• 1.3.2 NDV的生物学特性22
• 1.3.3 NDV分子致病机制22-24
• 1.4 干扰素诱导跨膜蛋白的研究进展24-26
• 1.4.1 病毒抑制因子—干扰素诱导蛋白24-25
• 1.4.2 IFITM的发现25
• 1.4.3 IFITM抗病毒研究进展25-26
• 1.5 本研究的目的和意义26-27
• 第二章 鸡传染性支气管炎病毒感染鸡肾脏转录组学分析.27-47
• 2.1 材料和方法28-30
• 2.1.1 病毒和实验动物28
• 2.1.2 主要试剂28
• 2.1.3 主要实验仪器及软件28
• 2.1.4 动物感染试验及样品采集28
• 2.1.5 IBV抗体效价检测28
• 2.1.6 Real-time RT-PCR检测肾脏中病毒载量28-29
• 2.1.7 IBV感染鸡肾脏组织转录组分析29
• 2.1.8 数据处理29
• 2.1.9 生物信息学分析29-30
• 2.1.10 荧光定量RT-PCR验证差异表达基因30
• 2.2 结果30-44
• 2.2.1 临床症状及血清抗体检测结果30
• 2.2.2 肾脏中病毒载量30-31
• 2.2.3 IBV感染致死鸡肾脏组织转录组分析结果31
• 2.2.4 差异表达基因的生物信息学分析31-43
• 2.2.5 荧光定量RT-PCR验证部分差异表达基因43-44
• 2.3 讨论44-47
• 2.3.1 模式识别受体的差异表达情况45
• 2.3.2 IBV感染激活干扰素通路45-46
• 2.3.3 IBV感染激发炎症反应46
• 2.3.4 细胞凋亡参与IBV感染过程46-47
• 第三章 鸡传染性支气管炎病毒感染鸡脾脏转录组学分析47-62
• 3.1 材料和方法48-52
• 3.1.1 病毒和实验动物48
• 3.1.2 主要试剂48
• 3.1.3 主要实验仪器及软件48
• 3.1.4 动物感染试验及样品采集48-49
• 3.1.5 Real-time RT-PCR检测气管中病毒载量49
• 3.1.6 IBV感染鸡脾脏组织转录组分析49
• 3.1.7 数据处理49
• 3.1.8 生物信息学分析49
• 3.1.9 荧光定量RT-PCR验证差异表达基因49-52
• 3.2 结果52-59
• 3.2.1 检测气管中病毒RNA52
• 3.2.2 IBV感染早期和晚期脾脏组织转录组学分析结果52-58
• 3.2.3 差异表达基因的KEGG通路分析58
• 3.2.4 荧光定量RT-PCR验证部分差异表达基因58-59
• 3.3 讨论59-62
• 第四章 鸡干扰素诱导跨膜蛋白1抑制NDV和IBV复制的研究62-80
• 4.1 材料和方法63-68
• 4.1.1 病毒、菌株、细胞及质粒63
• 4.1.2 SPF鸡和鸡外周血红细胞63
• 4.1.3 主要试剂和仪器63
• 4.1.4 IFITM生物信息学分析及构建系统发育树63-64
• 4.1.5 检测chIFITM1 mRNA的体内外表达情况64
• 4.1.6 IBV和NDV感染后靶器官中chIFITM1 mRNA的表达情况64
• 4.1.7 过表达chIFITM对NDV和IBV复制的影响64-66
• 4.1.8 chIFITM1蛋白的亚细胞定位66
• 4.1.9 chIFITM蛋白相互作用研究66-68
• 4.2 结果68-77
• 4.2.1 chIFITM1的生物信息学分析68-70
• 4.2.2 chIFITM1体内外分布情况70-72
• 4.2.3 chIFITM1抑制NDV和IBV复制72-74
• 4.2.4 缺失N端和C端对chIFITM1抗病毒活性的影响74
• 4.2.5 chIFITM1和NDV HN蛋白的亚细胞定位情况74-75
• 4.2.6 chIFITM1的原核表达和纯化75-76
• 4.2.7 chIFITM1-His蛋白与EIF5A1蛋白的相互作用76-77
• 4.2.8 EIF5A1 抑制 NDV 复制77
• 4.3 讨论77-80
• 第五章 全文结论80-81
• 参考文献81-91
• 致谢91-92
• 作者简历92

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