绵羊程序性细胞死亡因子10（PDCD10）克

发布时间：2017-07-06 04:07

  本文关键词：绵羊程序性细胞死亡因子10（PDCD10）克隆、表达及功能研究

  更多相关文章： PDCD10 克隆 差异分析 RNAi 凋亡 增殖 布病

【摘要】：布鲁氏菌病是由布鲁氏杆菌(Brucella)引起的一种世界范围的人兽共患传染病，严重威胁人类健康和社会公共卫生安全。目前，布病的临床诊断主要依赖于血清学检测，该方法很难区分布鲁氏菌自然感染动物和疫苗接种动物，严重影响了布病的诊断及监控。因此，有必要建立一种能够区分布鲁氏菌自然感染与疫苗接种动物的鉴别诊断方法，这对于布病的防控和净化具有重要意义。针对该问题，本课题组前期构建了绵羊响应布鲁氏菌强弱毒株感染白细胞层SSHcDNA文库，并筛选获得了差异表达基因PDCD10。因此，本研究拟从克隆绵羊程序性细胞死亡因子10（简写为OaPDCD10）全长cDNA序列入手，分析其在布鲁氏菌感染羊和疫苗接种羊间的差异表达情况，并利用RNAi技术研究该蛋白的生物学功能。旨为进一步阐明OaPDCD10与布病发生的关系、寻找鉴别布鲁氏菌自然感染与疫苗接种动物的诊断标志物提供科学依据。为此，本文主要对以下几个方面进行了研究： 一、OaPDCD10基因全长cDNA的克隆及序列分析 根据已获得的OaPDCD10部分mRNA序列，采用RACE技术对其全长cDNA序列进行扩增，并用相应的软件进行生物信息学分析。结果表明：OaPDCD10全长cDNA序列为1343bp，GenBank登录号为KC425616。其中5’-非编码区（untranslated region，UTR)为273bp，开放阅读框（open reading frame，ORF）为639bp，3’-UTR为431bp（包括poly A尾巴结构）。ORF被预测编码212个氨基酸残基，预测的蛋白分子量（MW）为24.71kDa、等电点（pI）为8.20。多重比对分析表明，PDCD10是一个高度保守的蛋白，OaPDCD10与鼠的（GenBank登录号：NP_062719)氨基酸序列同源性最高，为100%。另外，OaPDCD10被预测是由7个-螺旋紧密压缩构成的接头蛋白，有5个Ser磷酸化位点、无催化结构域、无跨膜结构域、无信号肽。 二、OaPDCD10基因差异表达的验证及分析 根据已获得的OaPDCD10全长cDNA序列设计引物，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术分析OaPDCD10mRNA的组织分布，验证OaPDCD10mRNA在布鲁氏菌感染羊和疫苗接种羊间的差异表达情况。组织分布结果表明，OaPDCD10mRNA在所有检测的组织中都有表达，其在心脏中的表达量最高，其次是瘤胃、肾、肝、脾和骨骼肌，而在肺、白细胞层及小肠中的表达量最低，且三者之间没有显著性差异。差异分析结果表明，感染组和疫苗组的OaPDCD10mRNA均以时间依赖的方式逐渐上调表达(p0.05或p0.01)，，且疫苗组要高于感染组。在接种细菌30d后，OaPDCD10mRNA在疫苗组和感染组间存在显著(*p0.05)或极显著(**p0.01)差异。提示OaPDCD10在布鲁氏菌病发生过程中很可能发挥重要的作用。 三、OaPDCD10的原核表达、纯化及特性 本研究构建了OaPDCD10原核表达载体pET30a-OaPDCD10，并对其进行诱导表达和纯化。结果表明，在28℃、0.4mM IPTG诱导4h的条件下，重组OaPDCD10蛋白（rOaPDCD10）诱导表达量最高。经SDS-PAGE和Western blot验证，rOaPDCD10大小约为28kDa，比预测的24.71kDa略大些。纯化的rOaPDCD10蛋白条带单一，浓度为0.4mg/ml。为了初步验证rOaPDCD10的生物学活性，我们以293T细胞为研究对象，观察纯化的rOaPDCD10对293T细胞的增殖及凋亡的影响。结果表明，将纯化的rOaPDCD10（50μg/ml）作用于293T细胞12h、24h、36h后，处理组的细胞凋亡率随着时间的延长而逐渐降低，分别为89.07%、86.85%、84.22%，但均高于空白对照组（77.89%）。MTT结果表明，与空白对照组相比，纯化的rOaPDCD10（50μg/ml）处理组的293T细胞的活力显著增强（p0.05or p0.01）。表明纯化的rOaPDCD10具有诱导细胞凋亡、促进细胞增殖的能力，但细胞的凋亡率随着时间的延长却逐渐下降。 四、OaPDCD10单克隆抗体的制备 本研究以纯化的rOaPDCD10为免疫原免疫小鼠，采用经典的淋巴细胞融合技术进行细胞融合，利用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞株，最终成功地获得了两株稳定分泌抗OaPDCD10单克隆抗体的杂交瘤细胞株。而且，抗OaPDCD10的单克隆抗体特异性好，能够与重组的、天然的OaPDCD10蛋白特异性结合。 五、OaPDCD10过表达对细胞增殖及凋亡的影响 为了阐明OaPDCD10的生物学功能，本研究构建了真核过表达载体pLV5-OaPDCD10-GFP，转染293T细胞，观察OaPDCD10过表达对细胞增殖及凋亡的影响。采用Western blot技术分析OaPDCD10的蛋白表达，MTT法检测细胞生长情况，hoechst33342/PI染色形态学法及AnnexinⅤ染色流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果表明，在转染后48h，OaPDCD10过表达组中OaPDCD10蛋白的表达量显著增高（p0.05），是空白对照组的1.55倍。与空白对照组相比，OaPDCD10-GFP转染组的293T细胞活力显著增强（p0.05）。而OaPDCD10-GFP转染组的293T细胞凋亡率为81.3%，低于阴性对照组（GFP）（85.37%），但仍高于空白对照组（77.89%），表明OaPDCD10过表达能够促进细胞的增殖而抑制细胞的凋亡。 六、PDCD10沉默对细胞增殖及凋亡的影响 为了进一步确认PDCD10的功能，本研究设计并构建了两条人羊同源的、靶向PDCD10的shRNA干扰质粒载体，转染293T细胞，观察PDCD10表达沉默对细胞增殖及凋亡的影响。采用Western blot技术分析PDCD10的蛋白表达，MTT法检测细胞生长情况，hoechst33342/PI染色形态学法及AnnexinⅤ染色流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果表明，在转染后48h，与空白对照组相比，sh1和sh2干扰组中PDCD10蛋白的表达分别下调至76.1%（p0.05）、25.7%（p0.01）。因此，选择sh2进行后续的功能验证。与空白对照组相比，PDCD10干扰组的293T细胞活力显著降低（p0.01）。而PDCD10干扰组中293T细胞的凋亡率为90.73%，高于阴性对照组（shNC）（84.96%），更高于空白对照组（77.89%），表明PDCD10沉默表达能够抑制细胞的增殖而促进细胞的凋亡。
【关键词】：PDCD10 克隆 差异分析 RNAi 凋亡 增殖 布病
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S826
【目录】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 英文缩略词表12-17
• 引言17-19
• 第一篇 文献综述19-45
• 第1章 布鲁氏菌病研究进展19-33
• 1.1 布鲁氏菌概述19-20
• 1.2 布鲁氏菌致病性20-21
• 1.3 布鲁氏菌胞内生存机制的研究21-27
• 1.4 布鲁氏菌免疫逃逸机制的研究27-31
• 1.5 小结31-33
• 第2章 PDCD10 研究进展33-39
• 2.1 PDCD10 概述33-34
• 2.2 PDCD10 功能结构域34-35
• 2.3 PDCD10 与凋亡35-36
• 2.4 PDCD10 与血管生成36-37
• 2.5 PDCD10 与肿瘤37
• 2.6 小结37-39
• 第3章 布鲁氏菌与凋亡39-45
• 第二篇 研究内容45-127
• 第1章 OaPDCD10 基因全长 cDNA 的克隆及序列分析45-61
• 1.1 材料45-46
• 1.2 方法46-53
• 1.3 结果53-58
• 1.4 讨论58-60
• 1.5 小结60-61
• 第2章 OaPDCD10 基因差异表达的验证及分析61-69
• 2.1 材料61-62
• 2.2 方法62-64
• 2.3 结果64-65
• 2.4 讨论65-67
• 2.5 小结67-69
• 第3章 OaPDCD10 的原核表达、纯化及特性69-91
• 3.1 材料69-71
• 3.2 方法71-80
• 3.3 结果80-88
• 3.4 讨论88-90
• 3.5 小结90-91
• 第4章 OaPDCD10 单克隆抗体的制备91-99
• 4.1 材料91-92
• 4.2 方法92-95
• 4.3 结果95-97
• 4.4 讨论97-98
• 4.5 小结98-99
• 第5章 OaPDCD10 过表达对细胞增殖及凋亡的影响99-111
• 5.1 材料99-100
• 5.2 方法100-104
• 5.3 结果104-109
• 5.4 讨论109-110
• 5.5 小结110-111
• 第6章 PDCD10 沉默对细胞增殖及凋亡的影响111-127
• 6.1 材料111-112
• 6.2 方法112-116
• 6.3 结果116-121
• 6.4 讨论121-125
• 6.5 小结125-127
• 结论127-129
• 参考文献129-157
• 导师简介157-159
• 作者简介159-161
• 攻读学位期间发表的学术论文161-163
• 致谢163

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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本文编号：524656