苎麻转抗旱基因的功能评估及抗旱转录组研究

发布时间：2017-07-07 12:04

  本文关键词：苎麻转抗旱基因的功能评估及抗旱转录组研究

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【摘要】：苎麻是中国重要的天然纤维作物之一,且被广泛种植在印度和其他东南亚和环太平洋国家。苎麻的生物产量比较高,长江流域一年可收获三季,在雨水充足的菲律宾地区甚至可以收获六季。由于研究起点较低、研究人员缺乏等原因,在Gen Bank中注册的苎麻EST序列仅421条(截至2015年4月9日),且缺乏可参考的基因组图谱信息。生物学信息的缺乏,严重阻碍了苎麻分子生物学的发展。本文利用转录组测序技术,鉴定到了一些抗旱相关的转录因子。通过建立的试管苗叶脉的遗传转化体系。转化了一个水稻干旱胁迫响应的NAC家族的转录因子SNAC1,进行了转录因子功能的验证。并且对抗旱材料进行了组学研究。本文的主要结果如下:1.采用“华苎5号”试管苗为实验材料,首次以试管苗叶脉为外植体建立一个高效的根癌农杆菌介导的苎麻遗传转化体系。然后测定了叶脉再生对卡那霉素的敏感性,筛选出叶脉遗传转化过程中选择培养时最佳卡那霉素浓度为40 mg L-1。2.优化了“华苎5号”叶脉遗传转化过程中影响转化的一些因素:叶龄、农杆菌浓度、共培养时间、农杆菌浸染时间以及共培养时培养基中乙酰丁香酮的浓度。得到产生最高遗传转化效率的具体条件为:以取自40 d试管苗苗龄的叶脉为外植体,农杆菌菌液浓度OD600值为0.6,菌液浸染时间为10 min,共培养时培养基中乙酰丁香酮浓度为50 mg L-1,共培养时间为3d。以上条件能够达到的平均转化效率为23.25%。利用GUS和NPTⅡ基因的特异性引物进行的PCR检测、Southern杂交检测、GUS染色组织化学分析等进一步证明了目的基因整合到苎麻基因组并在转基因苎麻中得到表达。3.利用已建立的苎麻叶脉遗传转化体系,转化了一个水稻NAC(NAM,ATAF and CUC2)家族的SNAC1基因。对SNAC1基因不同转基因家系进行PCR检测。随机选择转基因株系1,3,18和20做Southern拷贝数分析,检测结果显示SNAC1转基因株系1,3和18为单拷贝的,转基因株系20是双拷贝的,随机选择转基因株系3和20做后续的分析。荧光定量结果表达分析证明,与对照相比,转基因株系3和20目的基因均过量表达。4.对转基因株系3和20三个生长时期即苗期,旺长期和纤维成熟期的植株做了抗逆性分析。苗期采用10%(w/v)PEG6000模拟干旱胁迫,对照组是培养在1/2的霍格兰营养液中。苗期抗逆性分析结果显示转基因株系3和20在干旱胁迫处理条件下,鲜重和干重明显的高于野生型。旺长期实验材料的干旱胁迫方法采用饱和灌溉,然后去除多余的水,抑制浇水,进而观察植株的表型。实验结果表明,旺长期胁迫后,转基因家系比野生型植株的净光合速率、叶片相对含水量、脯氨酸、POD活性高,而丙二醛的含量则较低。干旱胁迫纤维成熟期的材料,其地上部分鲜重、鲜茎重、鲜皮重、干皮重,均比野生型植株高。综上所述,转基因植株比野生型植株具有较强的抗旱性。5.本项研究中,对干旱胁迫的“华苎5号”利用15%(w/v)PEG6000进行干旱胁迫。对处理(0h,12h,24h,48和72h)的叶片进行叶片相对含水量、脯氨酸、丙二醛和POD活性测定。根据这些生理指标的变化规律分析,选择干旱胁迫处理0h,24h和72h的叶片和根提取RNA。获取c DNA集合,并利用Illumina配对末端测序技术对其进行转录组分析,从而产生1.7亿个原始测序读长。在经PEG处理24h(L2和R2)和72h(L3和R3)的叶和根中共有16,798个基因差异性表达,其中,叶片中有9,281个,根中有8,627个。在这些基因中,来自AP2(3)、MYB(6)、NAC(9)、zinc finger(5)及b ZIP(2)家族的25个转录因子(TFs)被认为与干旱胁迫相关。我们将进一步研究这些转录因子在苎麻抗旱中的作用及其机理。
【关键词】：苎麻 叶脉 转基因 干旱胁迫 转录组
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S563.1
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 缩略词表12-13
• 第一章 文献综述13-22
• 1 苎麻抗旱研究13-16
• 1.1 干旱胁迫对植物的影响13-14
• 1.2 植物的抗旱机制14-15
• 1.3 苎麻的抗旱研究进展15-16
• 2 苎麻转基因研究16-18
• 2.1 转基因作物的研究16
• 2.2 转基因苎麻的研究16-18
• 3 苎麻转录组学研究18-20
• 3.1 转录组测序在植物上的应用18-19
• 3.2 苎麻转录组测序研究19-20
• 4 本课题的提出20-22
• 第二章 根癌农杆菌介导苎麻叶脉遗传转化体系的建立22-40
• 1 前言22-23
• 2 实验材料和方法23-28
• 2.1 实验材料23-24
• 2.2 实验方法24-28
• 3 结果与分析28-38
• 3.1 苎麻叶脉外植体的再生对Km的敏感性28-29
• 3.2 影响转基因植株转化及再生效率因子的优化29-32
• 3.3 转基因植株的产生32-34
• 3.4 转基因苎麻植株的分子检测分析34-38
• 4 讨论38-40
• 4.1 以叶脉为外植体的苎麻遗传转化38-39
• 4.2 以苎麻叶脉为外植体的苎麻遗传转化主要影响因子39-40
• 第三章 水稻SNAC1 基因对苎麻的遗传转化及其抗逆性研究40-59
• 1 前言40-41
• 2 实验材料和方法41-46
• 2.1 实验材料41
• 2.2 实验方法41-46
• 3 实验结果及分析46-57
• 3.1 SNAC1 转基因植株的分子检测46-47
• 3.2 SNAC1 基因的表达增强了苗期材料的抗旱耐盐性47-49
• 3.3 SNAC1 基因的表达增强了旺长期材料的抗旱耐盐性49-52
• 3.4 SNAC1 基因表达增强了纤维成熟期苎麻材料的抗旱耐盐性52-54
• 3.5 复水处理对转基因和野生型苎麻植物的影响54-57
• 4 讨论57-59
• 4.1 SNAC1 基因在苎麻抗逆育种中的应用价值57-58
• 4.2 SNAC1 转基因植株抗逆性的分析58-59
• 第四章 PEG模拟干旱条件下的苎麻转录组分析59-77
• 1 前言59-60
• 2 材料和方法60-64
• 2.1 植株材料的准备、RNA的提取及cDNA文库的建立60-61
• 2.2 序列的拼接、注释及GO Terms/KEGG通路的建立61
• 2.3 差异表达的冗余性和富集性分析61-62
• 2.4 实时定量RT-PCR62-64
• 2.5 RWC、MDA、脯氨酸含量和POD值的测定64
• 3 实验结果64-72
• 3.1 苎麻对干旱胁迫的生理响应64-65
• 3.2 Illumina测序、读取拼接及注释65-67
• 3.3 功能性分类与代谢途径分配67-68
• 3.4 基因差异性表达分析68-69
• 3.5 响应干旱转录因子的确定69-72
• 4 讨论72-77
• 4.1 PEG处理下生理指标的变化72-73
• 4.2 苎麻响应干旱胁迫的转录因子的五个主要家族73-77
• 第五章 展望77-79
• 1.多种外植体遗传转化体系的建立77
• 2. 转录组测序发现的抗旱相关的转录因子后期功能验证77
• 3. 苎麻抗旱蛋白质组学77-79
• 参考文献79-94
• 附录A94-98
• 附录B 攻读博士期间撰写及发表论文情况98-100
• 致谢100-101

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：530090