拟南芥分泌肽PIP1调节植物免疫的分子机制

发布时间：2017-07-19 17:33

  本文关键词：拟南芥分泌肽PIP1调节植物免疫的分子机制

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【摘要】：病原微生物是影响植物生长发育和限制作物产量的主要威胁之一。因此,揭示植物免疫机制对于发展抗病、高产的现代化农业具有重要意义。已有研究表明,植物可以依靠细胞表面模式识别受体识别病原菌相关分子模式pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)启动PAMPs-触发免疫(PTI, PAMP-Triggered Immunity)。此外,植物还能够通过细胞表面受体识别内源信号分子,比如肽类、胞外ATP (e ATP),触发PTI类似反应。水杨酸、乙烯等植物激素对PTI的调控发挥至关重要的作用。近年来研究发现,一类新的植物激素——分泌肽在调节植物生长发育和响应外界胁迫等生理进程中发挥重要的作用,然而它们参与植物免疫调节的分子机制尚未被深入研究。为了鉴定可能参与拟南芥PTI调节的植物肽信号,本研究通过分析PAMP flg22诱导的拟南芥转录组,鉴定了25个被flg22诱导上调表达的肽前体基因。其中,三个未知功能基因(At4g28469、At4g37290和At2g23270,分别命名为prePIP1、preP1P2和prePIP3)属于同一基因家族。该家族基因进化上比较保守。同源比对分析显示拟南芥至少具有11个该家族成员,在大豆、葡萄、玉米和水稻等其他多种单子叶植物和双子叶植物中也具有其同源基因。序列分析显示该家族蛋白为典型的分泌肽前体蛋白,其N端具有信号肽,C端具有-13氨基酸组成的保守区,信号肽和保守区之间为序列保守性低的可变区。为了分析该基因家族可能的功能,我们对其代表成员prePIP1的转录调控、表达模式、细胞定位、功能位点进行了系统分析。结果显示,病原菌Pseudomonas syingae、 Fusarium oxygenium、PAMPs flg22、几丁质和激素水杨酸能够诱导prePIPl表达。通过对prePIP1p：：GFP转基因拟南芥荧光显微观察,我们发现prePIP1主要在保卫细胞、水孔、表皮毛和维管组织中表达。荧光显微观察瞬时表达prePIP1-GFP融合基因的烟草叶片显示prePIP1定位于胞外。蛋白体外切割分析和质谱分析显示拟南芥胞外蛋白能够在prePIP1 C端进行切割,并释放C端保守区组成的肽。体外施加化学合成的prePIP1 C端13个氨基酸组成的多肽PIP1能够模拟过表达prePIP1引起的拟南芥主根生长变短的表型,表明PIP1可能作为prePIP1的成熟肽发挥其生理功能。通过比较脯氨酸未羟基化和羟基化的PIP1对主根生长抑制的活性,我们还发现PIP1的第5个脯氨酸(Pro-5)羟基化能够提高该多肽的根抑制活性。为了阐明PIP1的免疫相关作用机制,我们分析了该多肽的免疫诱导活性。通过prePIP1全长、N端信号肽或C末端保守区缺失基因分别与PTI标志基因FRK1启动子启动的萤光虫荧光素酶基因(Luciferase, LUC)共转化的拟南芥叶肉细胞原生质体,并分析转化原生质体LUC活性,结果显示原生质体表达的prePIP1能够激活FRK1表达依赖于其C末端保守区。对化学合成的Pro-5羟基化修饰的PIP 1多肽进行免疫诱导活性分析,结果显示PIP1能够诱导包括免疫基因表达、MAPK激活、ROS产生、气孔关闭和胼胝质沉积等免疫反应和增强拟南芥对病原细菌Pst DC3000的抗性。并且,过表达prePIP1和prePIP2能够增强拟南芥对根寄生真菌Foc699的抗性。以上结果表明PIP1能够激活PTI类似免疫反应和增强拟南芥对病原菌的抗性。为了鉴定PIP1的受体,我们分析了PIP1在部分受病原菌诱导表达的XI LRR-RLK基因突变体上的相关活性。结果显示PIP1在rlk7突变体上不能抑制根生长和诱导免疫反应。通过生物素-推拉实验、化学交联和受体-配体结合分析证明RLK7为PIP1的受体。为了进一步揭示PIP1-RLK7介导的植物免疫信号机制,我们对比分析了PIP1-RLK7与PEP1-PEPR1的作用机制。结果显示二者激活的早期免疫反应均依赖于BAK1,而只有PEP1-PEPR1信号依赖于BIK1。并且,两个信号通路之间存在协同作用,二者共同参与对拟南芥PTI的放大。此外,我们还分析了PIP1诱导的拟南芥转录组。结果显示PIP1能够上调与flg22、PEP1类似的早期免疫相关基因表达。由于PIP1和flg22共同诱导上调表达的基因显著富集BTH(SA功能类似物)诱导表达基因,RLK7突变显著降低了flg22诱导的SA信号通路相关基因表达。并且,prePIP1过表达能够促进flg22和SA诱导的PR1表达和对病原菌Pst DC3000的抗性,相反RLK7突变减弱了flg22和SA诱导的PRl表达和对病原菌DC3000的抗性。以上结果表明PIP1-RLK7能够通过激活SA信号增强flg22信号。此外,我们还发现SA信号能够促进flg22对prePIP1的诱导表达,而JA信号抑制了对prePIP1的诱导表达。因此,PIP1-RLK7信号和SA信号通过形成正反馈回路来放大flg22诱导的免疫信号。综上所述,我们在拟南芥中鉴定了一类新的分泌肽PIP1及其受体RLK7。并且,我们证明PIP1-RLK7通过与SA激素信号形成正反馈回路放大flg22诱导的PTI信号。
【关键词】：植物免疫 分泌肽 受体激酶 水杨酸
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S432.2
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 第1章 文献综述11-45
• 1.1 植物免疫系统11-13
• 1.2 PAMPs和PTI激活13-20
• 1.3 植物内源免疫激发子20-25
• 1.4 植物分泌肽参与的免疫调节25-28
• 1.5 类受体激酶(Receptor-like kinases,RLKs)28-35
• 1.6 PRRs介导的植物免疫激活及信号转导35-43
• 1.7 研究目的和主要研究内容43-45
• 1.7.1 研究目的43-44
• 1.7.2 主要研究内容44-45
• 第2章 实验材料与方法45-60
• 2.1 材料与方法45-60
• 2.1.1 材料和试剂45-48
• 2.1.2 方法48-60
• 第3章 结果与分析60-96
• 3.1 flg22诱导上调表达的肽前体基因的鉴定60-61
• 3.2 flg22诱导上调表达的分泌肽前体蛋白序列分析61-64
• 3.3 prePIP1的亚细胞定位及体外蛋白切割分析64-68
• 3.4 prePIP1的表达分析68-70
• 3.5 PIP1抑制拟南芥根生长70-72
• 3.6 PIP1诱导免疫反应发生和增强拟南芥对Pst DC3000的抗性72-74
• 3.7 PrePIP1和prePIP2参与拟南芥根部免疫74-77
• 3.8 RLK7是PIP1的受体77-83
• 3.9 PIP1-RLK7信号依赖于BAK183
• 3.10 PIP1-RLK7信号不依赖于BIK183-85
• 3.11 PIP1-RLK7对PAMP flg22信号起放大作用85-87
• 3.12 PIP1调控的拟南芥转录组分析87-89
• 3.13 PIP1通过诱导SA信号参与植物免疫调节89-92
• 3.14 PIP1-RLK7调控SA依赖的flg22信号92-94
• 3.15 flg22和SA共同参与上调prePIP1表达94-96
• 第4章：结论96-98
• 第5章：讨论与展望98-107
• 5.1 讨论98-104
• 5.1.1 flg22诱导上调表达的分泌肽前体基因98-99
• 5.1.2 prePIP1的成熟加工99-101
• 5.1.3 PIP1激活依赖于RLK7的免疫反应和参与对病原菌的抗性101-102
• 5.1.4 PIP1-RLK7调控的植物免疫机制102-104
• 5.2 展望104-107
• 参考文献107-123
• 附录123-128
• 致谢128-129
• 附件129

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本文编号：564072