AvrRxo1调控水稻维生素B6合成影响水稻对条斑病抗性

发布时间：2017-07-21 05:03

  本文关键词：AvrRxo1调控水稻维生素B6合成影响水稻对条斑病抗性

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【摘要】：水稻细菌性条斑病(简称条斑病)是由条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola, Xoc)引起的,是水稻生产上危害严重的细菌病害之一。迄今尚未发现对条斑病菌免疫的水稻材料,也未从水稻中鉴定出控制条斑病的主效抗病基因。这一现象可能是由于条斑病菌中存在一个或多个依赖三型分泌系统的抑制因子,能够抑制水稻防御基因产生的抗性。解析这些抑制因子的作用机理将有望破解水稻上缺失对条斑病主效抗性基因的谜题,对研发控制水稻条斑病危害的措施具有指导意义。为了克隆条斑病菌中的抑制因子,本研究构建了条斑病菌小种RS105的全基因组文库,并将文库质粒转化至白叶枯病菌PXO99A中,在水稻抗性材料IRBB21上筛选病斑变长的感病克隆。对筛选到的感病克隆进行测序发现,其中2个克隆的插入片段携带有一个共同的三型效应分子——AvrRxo1。进一步研究发现,转有pHM1: avrRxo1的PXO99A在IRBB21上的致病性显著高于对照PXO99A (pHM1),说明效应分子AvrRxo1具有抑制因子的功能。与野生型条斑病菌RS105相比,avrRxol敲除突变体RS105△avrRxo1在成株期水稻上的致病力显著降低,而突变体回复菌株致病力得到恢复,表明效应分子AvrRxo1在条斑病菌侵染水稻的致病过程中发挥着毒性因子的作用,有利于条斑病的发生。为了明确效应分子AvrRxo1在条斑病菌致病过程中发挥毒性因子的作用机制,本研究采用酵母双杂交技术筛选到与AvrRxo1互作的水稻蛋白OsPDX1.2。OsPDX1.2为OsPDX1蛋白家族成员,该蛋白家族中的另两个成员——OsPDX1.1和OsPDX1.3,与OsPDXl.2在氨基酸序列上高度相似,经酵母双杂交验证发现,OsPDX1.1和OsPDX1.3也可以与AvrRxo1相互作用。采用双分子荧光互补实验和免疫共沉淀实验验证AvrRxo1与OsPDX1蛋白间互作的真实性。实验同时发现,AvrRxo1与OsPDXl蛋白各自的羧基端在该相互作用发挥着不可或缺的作用。另外,实验证明,OsPDX1家族蛋白成员自身和相互之间存在互作。此外,AvrRxo1也可以与拟南芥中AtPDX1蛋白家族成员及酵母中PDX1的同源蛋白SNZ1相互作用。这些结果表明,效应分子AvrRxo1可以与水稻(单子叶植物)、拟南芥(双子叶植物)、酵母(真菌)中的PDX1蛋白互作。与野生型对照相比,超量表达OsPDX1的转基因水稻对条斑病菌表现抗性,OsPDX1-RNAi转基因植株和敲除突变体对条斑病菌表现为更加感病,表明OsPDXl正向调控水稻对条斑病的抗性。研究发现,接种条斑病菌野生型菌株或突变体回复菌株能降低水稻中OsPDX1蛋白水平,而接种avrRxo1敲除突变体RS 105△avr Rxo1的水稻中OsPDX1蛋白水平与对照相比没有显著差异,暗示AvrRxo1可能具有蛋白酶活性。采用无细胞蛋白降解实验和原核表达纯化蛋白实验进一步证实AvrRxo1具有蛋白酶活性,能够降解OsPDX1蛋白。在拟南芥中诱导avrRxo1基因表达能够降低PDX1蛋白的水平。同时,研究发现AvrRxo1降解OsPDX1是依赖ATP的。PDX1在真菌和植物中的功能高度保守,参与维生素B6的从头合成。本研究发现,在本氏烟中瞬时表达avrRxo1基因能够降低本氏烟中维生素B6的水平。在水稻上接种条斑病菌野生型菌株或突变体回复菌株能够降低水稻叶片中维生素B6的水平,而接种avrRxo1敲除突变体RS 105△avrRxo1的水稻中维生素B6的水平与对照相比无显著差异。体外用维生素B6对水稻进行处理能够提高水稻对条斑病菌的抗性。综上,AvrRxo1可以通过降解PDX1蛋白影响植物中维生素B6的从头合成,从而利于条斑病的发生。AvrRxo1能够被非寄主抗性基因Rxol识别,并引起过敏性坏死反应。分析Rxol转基因水稻在接种条斑病菌后OsPDX1基因的表达情况发现,与野生型水稻材料相比,Rxol转基因水稻中OsPDX1.3转录水平显著提高。烟草瞬时表达实验结果证明,Rxol和avrRxo1共表达时能够诱导OsPDXl.3基因启动子驱动的绿色荧光蛋白的表达,而avrRxo1或Rxo1单独表达并没有此功能。酵母双杂交实验证实Rxo1蛋白可以直接与AvrRxo1蛋白互作,在烟草中共表达时Rxo1能够促进AvrRxo1蛋白进入细胞核。结合生物信息学预测结果,在OsPDx1.3基因的启动子上鉴定了一个顺式作用元件S000465,该顺式作用元件在AvrRxo1激活OsPDX1.3基因表达过程中发挥着重要作用。将S000465顺式作用元件与35Smini基础启动子融合来驱动GFP基因,同样可以被AvrRxo1诱导表达。酵母单杂交实验、凝胶阻滞实验证实了AvrRxo1蛋白与S000465元件间的相互作用。综上,在抗性基因Rxol存在的情况下,AvrRxo1蛋白的亚细胞定位发生变化,结合OsPDX1.3基因的启动子,激活OsPDX1.3基因表达,可能促进维生素B6的从头合成,对条斑病表现抗性。在利用酵母双杂交系统筛选互作蛋白时发现,AvrRxo1对酵母细胞具有毒性,而在培养基中添加维生素B6能够解除AvrRxo1的毒性。本研究分别在氨基端和羧基端对AvrRxo1蛋白进行荧光蛋白标记时也发现：当在氨基端标记荧光蛋白后,AvrRxo1对拟南芥细胞的毒性消失,而在羧基端进行荧光蛋白标记的AvrRxo1蛋白对拟南芥细胞仍具有毒性,转基因拟南芥根的伸长受到抑制。分析二者的亚细胞定位发现,YFP-AvrRxo1定位于细胞核中,而AvrRxo1-GFP定位于细胞膜上。在培养基中添加维生素B6可以解除AvrRxo1-GFP拟南芥受到的生长抑制,恢复AvrRxo1-GFP转基因植株根的伸长。这些研究结果表明,AvrRxo1发挥毒性功能可能与其降解PDX1影响维生素B6水平有关,毒性功能的发挥依赖其细胞膜定位。
【关键词】：
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S435.111.4
【目录】：

• 符号说明5-13
• 中文摘要13-16
• 英文摘要16-19
• 1 前言19-42
• 1.1 水稻条斑病的研究19-23
• 1.1.1 水稻条斑病的发生和分布19
• 1.1.2 水稻条斑病的症状19-20
• 1.1.3 水稻条斑病菌的研究20-21
• 1.1.3.1 水稻条斑病菌的命名20
• 1.1.3.2 水稻条斑病菌的形态学特征和理化性质20-21
• 1.1.3.3 水稻条斑病菌致病型的划分21
• 1.1.4 水稻条斑病抗病基因的遗传研究21-23
• 1.1.4.1 水稻对条斑病的数量抗性21-22
• 1.1.4.2 Rxo1基因克隆及抗性机制的研究22-23
• 1.2 黄单胞杆菌三型效应分子的研究23-32
• 1.2.1 三型效应分子抑制寄主植物抗性反应23-27
• 1.2.1.1 植物免疫系统23-24
• 1.2.1.2 病原相关分子模式和模式识别受体24-26
• 1.2.1.3 效应分子抑制植物抗性反应26-27
• 1.2.2 黄单胞杆菌三型效应分子27-32
• 1.2.2.1 野油菜黄单胞杆菌三型效应分子28-29
• 1.2.2.2 稻黄单胞杆菌TAL效应分子29-30
• 1.2.2.3 稻黄单胞杆菌非TAL(non-TAL)效应分子30-31
• 1.2.2.4 条斑病菌抑制水稻抗性反应的研究31-32
• 1.3 植物抗性基因作用机理32-33
• 1.3.1 基因对基因(gene for gene)假说32
• 1.3.2 防卫假说32-33
• 1.3.3 捕获假说33
• 1.4 蛋白质互作研究技术33-35
• 1.4.1 酵母双杂交34
• 1.4.2 双分子荧光互补34-35
• 1.4.3 免疫共沉淀35
• 1.5 蛋白质与DNA互作研究技术35-36
• 1.5.1 酵母单杂交技术35-36
• 1.5.2 凝胶阻滞分析36
• 1.5.3 染色体免疫沉淀技术36
• 1.6 维生素B6与植物生长发育和抗逆36-39
• 1.6.1 维生素B6的生物学功能36-37
• 1.6.2 维生素B6的合成途径37-39
• 1.6.2.1 磷酸脱氧木糖依赖的合成途径38
• 1.6.2.2 磷酸脱氧木糖不依赖的合成途径38
• 1.6.2.3 维生素B6补救合成途径38-39
• 1.6.3 维生素B6在植物抵御逆境中的作用39
• 1.7 本研究的目的和意义39-42
• 2 材料与方法42-59
• 2.1 植物材料与来源42
• 2.2 菌株与载体42-43
• 2.3 核酸、蛋白质操作43-45
• 2.3.1 植物DNA抽提43
• 2.3.2 RNA抽提43
• 2.3.3 RT-PCR和定量PCR分析43-44
• 2.3.4 蛋白质抽提与Western blot分析44-45
• 2.4 RS105全基因组文库的构建45-47
• 2.4.1 RS105基因组DNA提取45
• 2.4.2 RS105基因组DNA部分酶切45-46
• 2.4.3 pEN1载体的片段化及连接转化46
• 2.4.4 文库质粒转化至PX099A46-47
• 2.4.5 文库质粒测序47
• 2.5 酵母双杂交47-49
• 2.5.1 载体的构建47-48
• 2.5.2 酵母双杂交文库的创建48
• 2.5.3 Bait的自激活和毒性检测48
• 2.5.4 酵母双杂交文库的筛选48-49
• 2.6 水稻基因的克隆与转化49-50
• 2.6.1 超量表达载体的构建49
• 2.6.2 抑制表达载体的构建49
• 2.6.3 亚细胞定位载体的构建49
• 2.6.4 农杆菌介导的遗传转化49-50
• 2.7 病原细菌的接种、病情调查和细菌生长分析50-51
• 2.7.1 水稻条斑病菌接种和病情分析50
• 2.7.2 水稻条斑病菌生长数量统计50
• 2.7.3 白叶枯病菌接种和病情分析50-51
• 2.7.4 白叶枯病菌生长数量统计51
• 2.7.5 丁香假单胞菌接种和病情分析51
• 2.7.6 丁香假单胞菌生长数量统计51
• 2.8 蛋白质互作检测分析51-53
• 2.8.1 双分子荧光互补52
• 2.8.2 免疫共沉淀验证蛋白质互作52-53
• 2.9 PDX1蛋白检测53-55
• 2.9.1 水稻中蛋白水平的检测53
• 2.9.2 拟南芥中蛋白水平的检测53
• 2.9.3 无细胞蛋白降解分析53-54
• 2.9.4 原核表达、纯化蛋白54
• 2.9.5 体外AvrRxo1降解PDX1.2检测54-55
• 2.10 维生素B6含量的测定55
• 2.10.1 植物中维生素B6的提取55
• 2.10.2 HPLC定量分析维生素B655
• 2.11 DNA-蛋白质互作55-58
• 2.11.1 瞬时表达系统验证蛋白质调控基因表达55-56
• 2.11.2 酵母单杂交验证核酸-蛋白质间的互作56
• 2.11.3 凝胶阻滞实验验证AvrRxo1与S000465元件间的互作56-57
• 2.11.4 染色体免疫沉淀实验验证AvrRxo1与S000465元件间的互作57-58
• 2.12 转基因拟南芥的制备58-59
• 2.12.1 载体的构建58
• 2.12.2 拟南芥的转化58
• 2.12.3 DEX处理诱导基因表达58-59
• 3 结果与分析59-102
• 3.1 AvrRxo1是条斑病菌中的抑制子能够抑制水稻抗性反应59-65
• 3.1.1 RS105全基因组文库的构建59
• 3.1.2 在水稻IRBB21上筛选感病转化子59-60
• 3.1.3 抑制子亚克隆60-62
• 3.1.4 avrRxo1缺失影响条斑病在水稻上的致病力62-65
• 3.1.4.1 avrRxo1基因缺失影响条斑病菌在成株期水稻上的致病力62
• 3.1.4.2 avrRxo1基因缺失影响条斑病菌在成株期水稻上的生长繁殖62-63
• 3.1.4.3 avrRxo1基因缺失突变体竞争力低于野生型菌株63-64
• 3.1.4.4 avrRxo1互补菌株恢复对水稻的致病力64-65
• 3.2 AvrRxo1与OsPDX1蛋白互作65-75
• 3.2.1 AvrRxo1互作蛋白的筛选及验证65-71
• 3.2.1.1 AvrRxo1亚细胞定位65-66
• 3.2.1.2 Bait_(avrRxo1-a)和Bait_(avrRxo1-b)自激活和毒性检测66-68
• 3.2.1.3 利用酵母双杂交筛选与AvrRxo1互作的水稻蛋白68
• 3.2.1.4 利用BiFC验证AvrRxo1-OsPDX1.2互作68-69
• 3.2.1.5 CoIP验证AvrRxo1-OsPDX1.2互作69
• 3.2.1.6 鉴定AvrRxo1蛋白与OsPDX1.2蛋白互作的结构域69-70
• 3.2.1.7 鉴定OsPDX1.2蛋白与AvrRxo1蛋白互作的结构域70-71
• 3.2.2 OsPDX1基因家族71-75
• 3.2.2.1 AvrRxo1蛋白与OsPDX1.1、OsPDX1.3蛋白互作72
• 3.2.2.2 OsPDX1家族蛋白的亚细胞定位72-73
• 3.2.2.3 OsPDX1家族蛋白形成同源和异源二聚体73-74
• 3.2.2.4 OsPDX1家族蛋白与OsPDX2互作74-75
• 3.2.2.5 AvrRxo1与AtPDX1家族蛋白互作75
• 3.2.2.6 AvrRxo1与酵母SNZ1蛋白互作75
• 3.3 OsPDX1正向调控水稻对条斑病菌的抗性75-81
• 3.3.1 OsPDX1超量表达T0代转基因植株检测76-77
• 3.3.2 OsPDX1超量表达T1代转基因植株检测77-79
• 3.3.3 T-DNA插入突变体检测79-80
• 3.3.4 OsPDX1抑制表达T_0代转基因植株检测80-81
• 3.4 AvrRxo1具有蛋白酶活性能降解OsPDX1蛋白81-86
• 3.4.1 RS105接种影响水稻中OsPDX1蛋白水平82
• 3.4.2 AvrRxo1直接引起OsPDX1蛋白水平降低82-83
• 3.4.3 AvrRxo1直接降解OsPDX1蛋白83
• 3.4.4 AvrRxo1直接降解OsPDX1蛋白83-84
• 3.4.5 Western Blot检测AvrRxo1降解OsPDX1.284-85
• 3.4.6 AvrRxo1降解OsPDX1蛋白需要ATP的存在85
• 3.4.7 AvrRxo1点突变影响其蛋白酶活性85-86
• 3.5 AvrRxo1干扰水稻维生素B6合成来促进致病86-91
• 3.5.1 OsPDX1参与水稻维生素B6的合成86-88
• 3.5.1.1 超量表达OsPDX1基因对水稻维生素B6水平的影响86-87
• 3.5.1.2 抑制表达OsPDX1基因对水稻维生素B6水平的影响87-88
• 3.5.2 AvrRxo1干扰植物维生素B6的合成88-90
• 3.5.2.1 AvrRxo1干扰水稻维生素B6的合成88-89
• 3.5.2.2 AvrRxo1表达降低本氏烟中维生素B6的水平89-90
• 3.5.3 维生素B6能够解除AvrRxo1对酵母细胞的毒性90
• 3.5.4 维生素B6影响水稻对条斑病菌的抗性90-91
• 3.6 AvrRxo1蛋白调控OsPDX1基因表达91-96
• 3.6.1 AvrRxo1蛋白具有调控OsPDX1基因启动子的功能91-92
• 3.6.2 OsPDX1基因启动子中顺式作用元件分析92
• 3.6.3 OsPDX1.3基因启动子截短分析92-93
• 3.6.4 酵母单杂交检测AvrRxo1蛋白与S000465元件互作93-94
• 3.6.5 凝胶阻滞实验检测AvrRxo1蛋白与S000465元件互作94-95
• 3.6.6 染色体免疫沉淀实验检测AvrRxo1蛋白与S000465元件互作95
• 3.6.7 酵母双杂交检测AvrRxo1与RXO1间的蛋白互作95-96
• 3.6.8 Rxo1蛋白影响AvrRxo1蛋白亚细胞定位96
• 3.7 AvrRxo1蛋白功能具有广谱性96-99
• 3.7.1. avrRxo1诱导表达转基因拟南芥制备96-97
• 3.7.2 AvrRxo1表达降低拟南芥中PDX1蛋白水平97-98
• 3.7.3 AvrRxo1表达对拟南芥表现毒性98
• 3.7.4 AvrRxo1表达促进丁香假单胞菌番茄变种在拟南芥上致病98-99
• 3.8 AvrRxo1蛋白亚细胞定位影响其功能99-102
• 3.8.1 超量表达荧光蛋白标记的AvrRxo1蛋白转基因拟南芥制备99-100
• 3.8.2 不同位置标记荧光蛋白的AvrRxo1蛋白转基因拟南芥表型100-102
• 4 讨论102-110
• 4.1 AvrRxo1影响维生素B6合成的作用模型102-103
• 4.2 条斑病菌中抑制子的克隆进一步鉴定103-104
• 4.3 水稻对条斑病的阶段性抗性104-106
• 4.3.1 水稻对条斑病具有阶段性抗性104-105
• 4.3.2 水稻对条斑病的阶段性抗性与维生素B6的关系105-106
• 4.4 AvrRxo1蛋白定位与功能间的关系106-108
• 4.4.1 蛋白质定位与功能间的关系106
• 4.4.2 AvrRxo1毒性功能依赖其膜定位106-107
• 4.4.3 AvrRxo1无毒因子功能依赖其核定位107-108
• 4.5 OsPDX1的应用108
• 4.6 关于后续工作的设想108-110
• 5 参考文献110-129
• 6 附录129-130
• 7 致谢130-131
• 8 攻读学位期间发表论文情况131

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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