高致病性PRRSV诱导仔猪胸腺的损伤机制及PRRSV抗独特型抗体的免疫调控

发布时间：2017-07-20 02:00

  本文关键词：高致病性PRRSV诱导仔猪胸腺的损伤机制及PRRSV抗独特型抗体的免疫调控

  更多相关文章： 猪繁殖与呼吸综合征 胸腺 自噬 凋亡 抗独特型抗体 单链抗体

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)的病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)。该病在临床上主要引起母猪流产、死胎或木乃伊胎,并引起育肥猪和仔猪的呼吸障碍。1987年,美国首先报道该病,1996年我国首次分离并报道该病。PRRSV为单股正链(+)RNA病毒,归类于动脉炎病毒科,动脉炎病毒属。2006年5月,高致病性PRRS(HP-PRRS)从我国南方地区开始爆发,主要表现为发病猪群的“三高”,即体温高、发病率高、死亡率高,HP-PRRS的爆发导致我国养猪业损失巨大。许多研究表明,PRRSV变异毒株对中枢及外周免疫器官的噬性显著增强,除能引起胸腺严重萎缩外,还能导致外周免疫器的出血、坏死、淋巴细胞严重减少并伴随细胞凋亡现象。目前,PRRS/HP-PRRS的防控仍然是兽医病毒学及免疫学界的难题,感染宿主对PRRSV/HP-PRRSV的免疫应答仍不清楚。PRRSV/HP-PRRSV感染猪抗体产生较早且抗体滴度较高,但早期产生的抗体难以保护机体免受病毒的感染,甚至发挥抗体依赖性增强作用帮助病毒对机体造成更严重的伤害。本课题在前期研究的基础上,进一步研究HP-PRRSV感染诱导仔猪胸腺内自噬与凋亡情况,探讨HP-PRRSV对仔猪胸腺的损伤机制;研究PRRSV经典及变异毒株弱毒疫苗抗HP-PRRSV的作用机理;通过使用PRRSV GP5的抗独特型抗体调控机体的免疫网络,研究PRRSV感染与机体免疫网络的关系;探索PRRSV单克隆抗独特型单链抗体的免疫生物学功能。为进一步研究机体对PRRSV的免疫反应机制及免疫调控机制奠定基础。1、PRRSV感染引起胸腺内细胞的自噬和凋亡的研究细胞死亡是被周密调控的一系列复杂过程。凋亡,是一种程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)方式,用于维持机体自身平衡和内环境稳定,该过程受基因严格调控。自噬,也是程序性细胞死亡的一种方式,它是将受损的细胞器及大分子物质依赖溶酶体降解供机体重新利用的过程。很多疾病的发生及发展过程中,细胞凋亡与细胞自噬并存,它们在调控细胞死亡的过程中通路相互关联,互为调控。胸腺作为哺乳动物的中枢免疫器官之一,既介导细胞免疫,又为T细胞分化、发育提供场所。PRRSV感染可造成体内及体外培养细胞的凋亡及体外感染细胞的自噬现象,然而,HP-PRRSV感染引起仔猪胸腺萎缩,在萎缩的胸腺内细胞自噬情况未见相关报道。本实验目的是通过流式细胞技术、Western blot技术,研究HP-PRRSV感染仔猪胸腺诱导胸腺细胞的自噬与凋亡情况;通过免疫荧光共聚焦技术,阐明HP-PRRSV感染仔猪胸腺内病毒感染细胞、凋亡细胞与自噬细胞的关系,鉴定发生自噬细胞的类型。实验结果显示:HP-PRRSV感染仔猪的胸腺内,既存在细胞自噬现象,也存在细胞凋亡现象;自噬既可发生于病毒感染的细胞,也发生于病毒未感染细胞;发生自噬的细胞为CD14+细胞及胸腺上皮细胞,而占有胸腺中细胞总数85-90%的T细胞没有发生自噬,而发生了凋亡。2、PRRSV不同毒株弱毒疫苗对HP-PRRSV免疫保护作用的研究自2006年HP-PRRS在我国爆发以来,PRRSV疫苗在猪场中普遍使用。然而,由于PRRSV的免疫机制目前尚不清晰,PRRSV疫苗的选择及使用尚存在很大的争议。目前临床上流行的毒株以变异毒株为主,但经典PRRSV弱毒疫苗在使用中安全性较高,并对HP-PRRSV有交叉保护性,在临床上也被广泛使用。因此,本实验选用PRRSV经典株弱毒疫苗CH-1R株及变异毒株弱毒疫苗Hu N4-F112毒株免疫断奶仔猪,使用变异毒株HP-PRRSV Hu N4攻毒后,通过观察临床症状、病理组织学变化,检测血清中病毒载量、细胞免疫及体液免疫的变化,探讨不同毒株弱毒疫苗对变异毒株的免疫保护作用。实验结果显示:CH-1R、Hu N4 F112免疫的仔猪均有效的抵御HP-PRRSV的感染,二者在临床症状、眼观剖检变化、肺脏及胸腺的病理变化都明显优于HP-PRRSV攻毒组。然而,同Hu N4 F112免疫组相比,CH-1R组在疫苗免疫期膜蛋白抗体水平及HP-PRRSV感染后血清病毒载量都存在明显差异。PRRSV诱导机体产生的中和抗体主要是以膜蛋白抗体为主,Hu N4 F112免疫猪血清中的中和抗体在体外能有效阻止HP-PRRSV感染Marc-145细胞。本研究中,CH-1R免疫组与Hu N4 F112感染组在攻毒后血清病毒载量差异是否与同源毒株产生的中和抗体有关需进一步研究。3、PRRSV GP5抗独特型抗体影响PRRSV弱毒疫苗的使用效果我们前期研究发现,感染了PRRSV的猪体内可产生两种不同的针对GP5的抗独特型抗体,这两种抗独特型抗体可影响PRRSV感染猪的带毒状态。本实验目的是使用PRRSV GP5抗独特型抗体对机体进行免疫调控,观察抗独特型抗体对PRRSV弱毒疫苗的使用效果。实验猪群分别接种PRRSV GP5单克隆抗独特型抗体Mab2-5G2及自身抗独特型抗体,然后用CH-1R弱毒苗连续免疫两次,最后HP-PRRSV攻毒,每次操作时间间隔是14天。检测指标包括:观察临床症状、胸腺及肺的病理变化、血清中的病毒含量、细胞因子IFN-γ、IL-2/4/10及血清抗PRRSV特异性抗体和中和抗体水平,探讨PRRSV抗独特型抗体对CH-1R弱毒苗的调控效果。实验结果显示,PRRSV抗独特型抗体降低了PRRSV弱毒苗的使用效果,诱导机体在病毒感染之前产生较高水平的IL-4及较低水平的中和抗体。该猪群与同型对照猪群相比,病毒感染后体温较高且持续时间长,感染早期血清病毒含量较高。以上实验结果表明,当机体PRRSV抗独特型抗体存在时,频率较高地进行疫苗的接种可能对猪群带来一定的风险性。4、PRRSV单克隆抗独特型单链抗体免疫学特性研究MAb2-5G2是PRRSV GP5的抗独特型抗体,即“内影像”分子,能有模拟抗原表位而诱导机体的免疫反应,应用价值有待开发;而单链抗独特型抗体分子量小、没有毒性且易于穿入组织细胞又容易在大肠杆菌中大量表达,较抗独特型抗体优势明显。我们前期的研究表明经过复性后的原核表达MAb2-5G2 sc Fv具备MAb2-5G2的生物学功能,对MAb2-5G2 sc Fv的免疫学功能的研究发现:分别用MAb2-5G2v、sc Fv连续免疫兔子制备的抗血清能够与彼此的抗原发生交叉反应且二者的抗血清能够抑制HP-PRRSV感染Marc-145细胞。本实验进一步研究MAb2-5G2sc Fv的免疫学特性,使用MAb2-5G2及其sc Fv接种实验仔猪,结合PRRSV弱毒疫苗的使用,观察二者对弱毒疫苗使用效果的影响。实验猪群首先免疫接种PRRSV GP5单克隆抗独特型抗体Mab2-5G2或Mab2-5G2Sc Fv,然后接种一次CH-1R弱毒苗,最后接种HP-PRRSV,观察临床症状、胸腺及肺的病理组织学变化、检测病毒感染后血清病毒载量及血清抗PRRSV膜蛋白抗体水平。实验结果显示,MAb2-5G2 sc Fv保留了Mab2-5G2模拟GP5抗原的免疫学特性,二者在病毒感染后均较快地诱导机体产生了针对PRRSV膜蛋白的抗体,提高了HP-PRRSV感染仔猪的的成活率。
【关键词】：猪繁殖与呼吸综合征 胸腺 自噬 凋亡 抗独特型抗体 单链抗体
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 中文摘要6-9
• abstract9-17
• 第一章 猪繁殖与呼吸综合征研究进展17-32
• 1.1 PRRSV的病原学特点17-20
• 1.1.1 PRRSV病原结构特点18-19
• 1.1.2 病毒的结构蛋白19
• 1.1.3 病毒的非结构蛋白19-20
• 1.2 PRRSV感染与机体的免疫反应20-22
• 1.2.1 PRRSV感染与机体的体液免疫反应20
• 1.2.2 PRRSV诱导机体的细胞免疫反应20
• 1.2.3 PRRSV感染与抗体依赖性增强作用20-21
• 1.2.4 免疫网络学说21-22
• 1.2.5 单链抗体22
• 1.3 PRRSV的致病机制22-25
• 1.3.1 PRRSV细胞受体的研究23
• 1.3.2 PRRSV的感染对中枢免疫器官损伤的研究23-25
• 1.3.3 PRRSV感染可造成外周免疫器官的损伤25
• 1.4 PRRSV的感染与细胞的程序性死亡25-29
• 1.4.1 细胞自噬25-26
• 1.4.2 细胞凋亡26-27
• 1.4.3 PRRSV感染引起的自噬和凋亡27-29
• 1.5 PRRSV感染与防控29-32
• 1.5.1 PRRSV的传播途径29
• 1.5.2 PRRS的临床症状29-30
• 1.5.3 PRRSV的防控现状及其免疫30-32
• 第二章 本研究的目的与意义32-33
• 第三章 PRRSV感染引起胸腺内细胞的自噬和凋亡的研究33-50
• 3.1 试验材料34-36
• 3.1.1 试验动物和毒株34
• 3.1.2 主要试剂34
• 3.1.3 主要仪器34
• 3.1.4 主要试剂配制34-36
• 3.2 实验方法36-40
• 3.2.1 动物实验设计36
• 3.2.2 样品的采集及处理36
• 3.2.3 胸腺的眼观病理变化36
• 3.2.4 血清及胸腺内病毒载量的检测36-37
• 3.2.5 流式细胞术检测胸腺内细胞凋亡37-38
• 3.2.6 Western-blotting检测PRRSV感染后胸腺内自噬和凋亡相关蛋白38-39
• 3.2.7 免疫共聚焦检测PRRSV感染仔猪胸腺内自噬、凋亡情况39-40
• 3.2.8 免疫共聚焦检测PRRSV感染仔猪胸腺内自噬细胞类型的鉴定40
• 3.2.9 数据分析40
• 3.3 结果分析40-48
• 3.3.1 胸腺的眼观及病理变化40-41
• 3.3.2 血清及胸腺内病毒载量的检测41
• 3.3.3 流式细胞术检测胸腺内凋亡细胞41-42
• 3.3.4 Western-blotting检测PRRSV感染后胸腺内自噬和凋亡相关蛋白42-44
• 3.3.5 HP-PRRSV感染仔猪胸腺内细胞自噬、细胞凋亡情况的鉴定44-48
• 3.4 讨论48-49
• 3.5 小结49-50
• 第四章 PRRSV不同毒株弱毒疫苗对HP-PRRSV免疫保护作用的研究50-65
• 4.1 试验材料50-51
• 4.1.1 毒株和疫苗50-51
• 4.1.2 试验动物51
• 4.1.3 主要仪器及试剂51
• 4.2 实验方法51-54
• 4.2.1 动物实验设计51
• 4.2.2 临床症状和病理变化的观察51-52
• 4.2.3 样品处理52
• 4.2.4 胸腺重量与仔猪体重比值计算52
• 4.2.5 病毒血症检测52
• 4.2.6 外周血中淋巴细胞亚群变化52-53
• 4.2.7 PRRSV特异性抗体的检测53
• 4.2.8 细胞因子检测53-54
• 4.3 结果分析54-62
• 4.3.1 临床症状54-56
• 4.3.2 剖检变化56-57
• 4.3.3 病理组织学变化57-58
• 4.3.4 血清中病毒载量变化58-59
• 4.3.5 PRRSV膜蛋白抗体水平变化59-60
• 4.3.6 实验猪外周血T淋巴细胞亚群变化60-61
• 4.3.7 细胞因子的变化61-62
• 4.4 讨论62-64
• 4.5 小结64-65
• 第五章 PRRSV抗独特型抗体对弱毒苗的免疫调控65-80
• 5.1 试验材料66
• 5.1.1 毒株、疫苗和细胞66
• 5.1.2 试验动物66
• 5.1.3 主要仪器及试剂66
• 5.2 试验方法66-70
• 5.2.1 免疫原的制备66-67
• 5.2.2 试验设计67
• 5.2.3 临床症状和病理变化的观察67
• 5.2.4 样品采集及处理67-68
• 5.2.5 血清病毒含量检测68
• 5.2.6 PRRSV特异性抗体的检测68
• 5.2.7 病毒中和试验68-69
• 5.2.8 细胞因子的检测69-70
• 5.3 结果分析70-77
• 5.3.1 临床症状观察结果70-71
• 5.3.2 剖检结果观察71-72
• 5.3.3 肺脏和胸腺的病理学变化72-73
• 5.3.4 血清中病毒载量检测结果73-74
• 5.3.5 PRRSV特异性抗体的检测74-75
• 5.3.6 细胞因子的检测75-76
• 5.3.7 血清中和抗体的检测76-77
• 5.4 讨论77-78
• 5.5 小结78-80
• 第六章 PRRSV GP5 单克隆抗独特型单链抗体免疫学特性研究80-88
• 6.1 试验材料81
• 6.1.1 主要试剂及仪器81
• 6.1.2 毒株和疫苗81
• 6.1.3 实验动物81
• 6.2 试验方法81-82
• 6.2.1 免疫原的制备81
• 6.2.2 实验设计81-82
• 6.2.3 临床症状和病理变化的观察82
• 6.2.4 血清病毒含量检测82
• 6.2.5 PRRSV膜蛋白特异性抗体的检测82
• 6.3 结果分析82-86
• 6.3.1 临床症状观察结果82-83
• 6.3.2 剖检变化83-84
• 6.3.3 肺脏和胸腺的病理学变化84-85
• 6.3.4 血清病毒载量检测85
• 6.3.5 PRRSV膜蛋白抗体水平变化85-86
• 6.4 讨论86-87
• 6.5 小结87-88
• 全文总结88-89
• 本研究创新点89-90
• 参考文献90-105
• 致谢105-106
• 作者简介106

【参考文献】

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1 韦天超;田志军;安同庆;周艳君;肖燕;姜一峰;郝晓芳;张善瑞;彭金美;仇华吉;童光志;;猪繁殖与呼吸综合征病毒Taq Man-MGB荧光定量RT-PCR方法的建立和应用[J];中国预防兽医学报;2008年12期

2 于颖;王刚;宋腾飞;孔宁;马晓春;姚永红;肖一红;周恩民;;PRRSV GP5蛋白抗独特型单链抗体的构建表达及鉴定[J];中国预防兽医学报;2011年06期

3 何玉利;刘永刚;王刚;石文达;武嘉男;刘鹤;董建国;韩梓峰;姜成刚;田志军;蔡雪辉;;不同毒力猪繁殖与呼吸综合征病毒对仔猪肺和外周免疫器官损伤的研究[J];中国预防兽医学报;2012年01期

4 熊丁杰;徐志文;梅淼;余庆;彭西;刘彬;尹雪琴;刘万铃;;PRRSV感染致断奶仔猪肺脏和外周免疫器官的病理损伤[J];中国兽医学报;2011年05期

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1 乔松林;猪IgG Fc受体及其介导PRRSV抗体依赖增强作用研究[D];河南农业大学;2009年

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