烟草四种主要病毒分子变异及植物提取物WCT-Ⅱ抗TMV作用机理研究

发布时间：2017-08-07 04:00

  本文关键词：烟草四种主要病毒分子变异及植物提取物WCT-Ⅱ抗TMV作用机理研究

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【摘要】：烟草普通花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus,TEV)和马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)引起的病毒病害是我国烟草安全生产的重大威胁。为明确TMV,CMV,TEV和PVY在我国烟草产区的分布、分子变异等信息,本研究在我国12个烟草主产区展开病毒病害的调查与分析。在此基础上,进一步研究了植物提取物WCT-II的抗病毒活性和作用机理,为开发环境友好型植物病毒的防控技术提供了理论和物质基础。2010和2011年,本实验在我国12个烟草主产区共采集409份样品,利用DAS-ELISA和RT-PCR等技术对这些样品进行了分析。检测结果表明TMV,CMV,TEV和PVY广泛分布在我国12烟草主产区,平均检出率在50%以上。不同地区,病毒检出率呈现了多样性。陕西省烟草产区病毒危害最重,平均检出率为75.95%;其次为河南,检出率为74.78%;湖南检出率为74.26%;湖北最轻,检出率为58.69%。这些地区已经是烟草病毒病危害最为严重的地区,严重威胁当地烟草及其他经济作物的安全生产,因此有效控制病毒病的危害已经成为一项紧迫任务。在不同年份,这四种病毒的检出率也有差异。统计2010年和2011年的调查结果显示,烟草病毒在2010年平均检出率为76.62%,明显高于2011年的60%。这说明烟草病毒的检出率呈现动态的变化趋势,这可能与气候、农事活动等因素有关,因此多年份、多区域的调查才能较为真实的反应烟草病毒的危害情况。本实验从采集的样品中共分离鉴定到18个TMV分离物,21个CMV分离物,15个TEV分离物,21个PVY分离物。与在线数据比对显示,这四种病毒外壳蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列的一致率分别为:TMV是97%~100%和72%~100%,CMV为81%~100%和78%~100%,TEV为96%~100%和97%~100%,PVY为96%~100%和97%~100%。以这些分离物为基础,结合数据库在线数据,采用RDP4软件对这些分离物的外壳蛋白核苷酸序列进行了重组分析。3个明显的重组事件从这些分离分离物中鉴定得到,其中CMV分离物中鉴定出1个,TEV分离物中鉴定出1个,PVY分离物中鉴定出1个。Phylogenetic network分析结果表明CMV,TEV和PVY的分离物呈现非树形的Phylogenetic network树,说明重组对CMV,TEV和PVY遗传变异起着重要的作用,是影响CMV,TEV和PVY种群变异的重要因素。此外,利用MEGA软件计算了这些分离物的non-synonymous和synonymous sites(d N/d S比值)的比值。结果显示TMV,CMV,TEV和PVY分离物外壳蛋白的d N值明显小于d S值,即d N/d S ratio小于1,说明TMV,CMV,TEV和PVY分离物的外壳蛋白基因受到负向选择的影响。负向选择也是影响四种烟草病毒种群变异的重要因素。基于TMV,CMV,TEV和PVY外壳蛋白的核苷酸序列,利用MEGA4软件,系统分析这四种病毒的遗传变异。依据TMV分离物建立的系统发育树,34个TMV分离物(16个来自网上公布的序列)被分成了两个亚组,Group I和II(bootstrap support values60%)。38个CMV分离物分到了Subgroup I,5个CMV分离物分到了Subgroup II。39个TEV分离物(24个来源于数据库)被分成了四个组,Groups I,II,III和IV(bootstrap support values90%)。73个PVY分离物(52个来源于网上数据库)被分成了2个组,Group I和II(bootstrap support values90%)。该结果表明TMV,CMV,TEV和PVY分离物存在明显的遗传变异。为进一步分析这些分离物的多样性,本实验采用MEGA4软件分别计算了这些分离物组内和组间的遗传距离,结果表明组间的遗传距离明显大于组内的。这说明,组间的遗传多样性要大于组内的,进一步说明这四种病毒分离物存在明显的遗传多样性。有效的防治这些烟草病毒病已经成为了一大难题。针对这一难题,本实验采用半叶枯斑法、定量PCR等技术检测了生物源活性物质WCT-II抗TMV的活性、作用机理。在WCT-II处理普通烟草(Nicotiana tabacum)后,本实验采集了烟草叶片,测量了SOD酶、POD酶、PPO酶活性、过氧化氢含量的变化及PR-1基因表达量差异。目前实验结果表明,与对照组相比,WCT-II处理6 h后,SOD酶、POD酶、PPO酶活性及过氧化氢含量开始上升,同时,PR-1基因开始被诱导表达;12 h后,PPO活性和SOD活性出现峰值;在处理24 h后,POD酶活性出现峰值;PR-1基因表达量达到高峰,为对照组烟草的3.16倍;过氧化氢含量也达到高峰。随后,SOD酶、POD酶、PPO酶活性、过氧化氢含量的及PR-1基因表达量均逐渐下降到对照水平。该实验说明在温室条件下,WCT-II可以通过有效诱导烟草SOD酶、POD酶、PPO酶活性上升,诱导过氧化氢大量积累和PR-1基因的上调表达,最终诱导烟草产生抗TMV的活性。TMV,CMV,TEV和PVY在我国烟草主产区广泛分布,引起的病毒病害已经成为危害我国烟草安全生产的重要因素。这些病毒分离物存在明显的遗传变异,重组和负向选择是影响这些病毒类群遗传变异的重要因素。作为植物源活性物质,WCT-II能有效诱导烟草产生系统的抗病性,为有效防治TMV,CMV,TEV和PVY等烟草病毒提供了理论和物质基础。
【关键词】：烟草病毒 分子变异 重组 负向选择 WCT-II
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S435.72
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-14
• 第一章 文献综述14-39
• 1.1 植物病毒及其危害14-15
• 1.2 我国主要的烟草病毒病及分子生物学特性15-21
• 1.2.1 烟草普通花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV)15-16
• 1.2.2 黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV)16-18
• 1.2.3 烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus, TEV)18-20
• 1.2.4 烟草马铃薯Y病毒（Potato virus Y, PVY)20-21
• 1.3 植物病毒的检测技术21-30
• 1.3.1 生物学方法21-22
• 1.3.2 血清学检测技术22
• 1.3.3 电镜技术22-23
• 1.3.4 分子生物学检测技术23-29
• 1.3.5 其他检测方法29-30
• 1.4 植物RNA病毒的分子变异30-33
• 1.4.1 突变30-31
• 1.4.2 重组31-32
• 1.4.3 分子重排32-33
• 1.4.4 病毒RNA的缺失及缺失干扰33
• 1.5 植物源病毒抑制物质的研究进展33-37
• 1.5.1 植物源抗病毒活性物质34-36
• 1.5.2 植物源抗病毒物质作用机理36-37
• 1.6 本项目研究的目的与意义37-39
• 第二章 烟草主要病毒的发生39-52
• 前言39
• 2.1 材料与方法39-45
• 2.1.1 田间调查与样品采集39-40
• 2.1.2 引物设计40
• 2.1.3 血清学检测样品40-41
• 2.1.4 提取样品总RNA41-42
• 2.1.5 反转录扩增42-43
• 2.1.6 PCR分别扩增四种烟草病毒的外壳蛋白43
• 2.1.7 四种烟草病毒的外壳蛋白基因序列测定43-45
• 2.2 结果与分析45-50
• 2.2.1 田间感病烟草的症状表现45
• 2.2.2 烟草主要病毒的发生与分布45-46
• 2.2.3 TMV的发生与分布46-47
• 2.2.4 CMV的发生与分布47-48
• 2.2.5 TEV的发生与分布48-49
• 2.2.6 PVY的发生与分布49
• 2.2.7 烟草病毒在田间的侵染形式49-50
• 2.3 讨论50-51
• 2.4 小结51-52
• 第三章 烟草四种主要病毒的分子变异52-81
• 前言52
• 3.1 材料与方法52-54
• 3.1.1 样品采集52
• 3.1.2 RT-PCR52-53
• 3.1.3 外壳蛋白序列测定53
• 3.1.4 外壳蛋白序列分析53
• 3.1.5 多样性分析53
• 3.1.6 重组分析53
• 3.1.7 种群和选择压分析53-54
• 3.2 结果与分析54-78
• 3.2.1 四种烟草病毒分离物54-56
• 3.2.2 序列一致性分析56-63
• 3.2.3 系统发育树分析63-72
• 3.2.4 重组分析72-74
• 3.2.5 种群统计分析74-77
• 3.2.6 选择压分析77-78
• 3.3 讨论78-79
• 3.4 小结79-81
• 第四章 植物提取物WCT-II抗TMV活性分析81-92
• 前言81
• 4.1 材料与方法81-85
• 4.1.1 供试药剂和植物材料81
• 4.1.2 供试毒源81-82
• 4.1.3 设计TMV特异引物82
• 4.1.4 RNA提取82-83
• 4.1.5 RT-PCR83-84
• 4.1.6 Real-time PCR84
• 4.1.7 WCT-II抗TMV活性84-85
• 4.2 结果与分析85-90
• 4.2.1 TMV特异的实时荧光定量PCR体系85-87
• 4.2.2 WCT-II对TMV的钝化作用87-88
• 4.2.3 半叶枯斑法测定WCT-II对TMV的防治作用88-89
• 4.2.4 系统寄主上测定WCT-II对TMV的防治作用89-90
• 4.3 讨论90-91
• 4.4 小结91-92
• 第五章 植物提取物WCT-II抗TMV机理初步研究92-106
• 前言92
• 5.1 材料与方法92-99
• 5.1.1 供试材料92-93
• 5.1.2 引物设计93
• 5.1.3 SOD、PPO、POD活性测定93-96
• 5.1.4 过氧化氢含量测定96-97
• 5.1.5 烟草PR-1 基因表达量分析97-99
• 5.2 结果与分析99-104
• 5.2.1 WCT-II对SOD活性影响99-100
• 5.2.2 WCT-II对POD活性影响100-101
• 5.2.3 WCT-II对PPO活性影响101
• 5.2.4 WCT-II对过氧化氢影响101-102
• 5.2.5 烟草PR-1 基因特异的real-time PCR体系102-103
• 5.2.6 WCT-II对PR-1 基因表达量影响103-104
• 5.3 讨论104-105
• 5.4 小结105-106
• 第六章 结论和创新点106-107
• 参考文献107-118
• 附表118-124
• 致谢124-125
• 作者简介125

【参考文献】

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本文编号：632687