小麦泛素系统关键组分基因TaUb2和TaPUB1的功能分析

发布时间：2017-08-09 23:06

  本文关键词：小麦泛素系统关键组分基因TaUb2和TaPUB1的功能分析

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【摘要】：小麦(Triticum aestivum L.)是世界上最重要的粮食作物之一。小麦在生长发育过程中经常受到各种逆境胁迫。泛素/26S蛋白酶体系统(UPS)是植物中最重要的蛋白质周转机制之一。该系统主要由泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)、泛素连接酶(E3)、26S蛋白酶体和泛素组成。研究发现UPS参与许多生物过程,包括信号转导、细胞周期和逆境胁迫响应等。泛素是一个含有76个氨基酸的球状蛋白,存在于几乎所有的真核生物中,且高度保守。它主要以两种类型存在:单体泛素和多聚化泛素。在植物细胞中,游离态的泛素和结合态的泛素处于动态平衡中。尽管细胞内泛素水平相对较高,但是自由的未结合的泛素非常的少。在胁迫条件下,植物细胞会积累大量的异常和受损的蛋白质。及时清除这些非正常蛋白具有重要意义,而这个过程受自由态泛素水平的影响。E3连接酶是UPS系统的关键酶,它决定了被泛素化蛋白的特异性。根据亚基构成和作用机制,植物中的E3主要有:HECT结构域家族、RING结构域家族和U-box结构域家族等。U-box结构域最先在酵母中发现的,是一个大约含有75个氨基酸的高度保守的结构域。已鉴定的许多含U-box结构域的蛋白随后都发现具有E3连接酶的活性。本实验室之前克隆了小麦泛素基因TaUb2,并获得了过表达烟草(Nicotiana tabacum L.)株系。本文我们利用过表达TaUb2烟草研究了该基因在植物生物胁迫耐性中的功能。同时,我们还从小麦中分离到一个新的U-box基因TaPUB1。对该基因进行序列比对并对其表达模式进行分析。构建真核表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化本生烟,从而获得了TaPUB1过表达的本生烟植株。利用转基因植株对基因在逆境适应中的功能进行了深入研究。主要结论如下:1.TaUb2在植物生物胁迫耐性中的功能(1)丁香假单胞杆菌Pst DC3000属于革兰氏阴性细菌,被广泛地用于研究植物的生物胁迫响应。Pst DC3000处理后,与野生型烟草相比,TaUb2过表达烟草叶片中的细菌生物量减少且叶片坏死、萎黄现象较轻。同时还发现Pst DC3000处理小麦能显著上调内源TaUb2的表达。这些结果表明TaUb2过表达烟草能够提高对Pst DC3000的抗性。(2)经Pst DC3000处理后,转基因植物的气孔孔径变小,仅为野生型烟草的1/2-2/3。同时,我们又对感染Pst DC3000的各个株系叶片进行失水速率检测。结果发现,与野生型相比,过表达烟草的失水速率较慢,这与经Pst DC3000处理后过表达烟草叶片的气孔孔径较小一致。pstdc3000处理后,与野生型相比,过表达烟草的电解质外渗量和丙二醛含量较低,apx、pod和sod的酶活升高。这些结果表明,气孔开度的减小和抗氧化能力的提高可能参与转基因植株的抗病性。(3)注射pstdc3000后,转基因烟草中观察到更多的活性氧和超敏反应。同时,pstdc3000处理后,发现参与sar信号途径的几个pr基因在转基因烟草中上调幅度明显高于野生型烟草。这些结果表明ros诱导的、hr激活的sar可能参与转基因植株的抗病性。2.小麦u-box基因tapub1的克隆与功能研究(1)通过同源克隆策略从小麦中分离到一个u-box基因tapub1(jx307854)。该基因cdna全长为1932bp,开放阅读框为1593bp,共编码531个氨基酸。该蛋白的分子量约为57.8kda,等电点为5.96。该蛋白的n端有保守的u-box结构域和prp19超家族,c端有几个wd40重复片段。(2)将p35s-tapub1-gfp融合蛋白在洋葱和本生烟表皮中瞬时表达。通过荧光显微镜观察到荧光蛋白分布在胞质和细胞核中。(3)qrt-pcr检测tapub1在小麦不同部位的表达以及在各种外源激素和逆境胁迫处理下的内源tapub1的表达模式。结果表明tapub1在小麦根、茎和叶中均有表达,其中叶片中的表达最丰富。nacl、peg6000、cdcl2、pstdc3000等逆境胁迫均能诱导tapub1上调表达。外源施加植物激素如aba、sa、meja和eth也可不同程度地诱导该基因的表达。(4)将tapub1cdna全长正向插入到植物表达载体prok2的camv35s启动子的下游。利用农杆菌介导的叶盘法转化本生烟。通过抗性筛选、转录水平及蛋白水平的检测,最终选取了oe9、oe10、oe113个过表达株系并用于进一步的研究。结果发现,过表达tapub1提高了本生烟对盐胁迫的耐性。盐胁迫条件下,与野生型相比,过表达株系的种子萌发率较高,而且发芽速度快;与野生型植株相比,过表达tapub1幼苗及成苗在盐胁迫下表现出较长的主根,较高的叶绿素含量和较好的生长表型。这些说明过表达tapub1提高了本生烟的耐盐性。(5)盐胁迫下,过表达植株中积累较多的脯氨酸和可溶性糖,水势较低,表明转基因植株通过增加渗透调节物质的积累,降低水势,进而在一定程度上缓解由盐胁迫造成的水分胁迫。盐胁迫还会对植物造成离子毒害。过表达株系通过减少na+吸收,降低na+/k+比率,进而在一定程度上维持离子平衡,减轻离子毒害。盐胁迫存在的同时还伴随着氧化胁迫。转基因植株通过提高抗氧化酶的活性,及时清除ROS,进而减轻由ROS引发的氧化伤害。在盐处理时,一些渗透胁迫和抗氧化酶相关基因在转基因植物中的表达水平明显地高于野生型。(6)过表达TaPUB1还能提高本生烟对水分胁迫、重金属镉的耐性,同时增加了本生烟对Pst DC3000的感病性。(7)过表达TaPUB1影响本生烟的生长发育。对转基因本生烟的表型观察发现,过表达TaPUB1影响了本生烟的整个生长发育过程,包括种子大小、叶片厚度、叶片数目和株高等。
【关键词】：小麦(Triticum aestivum L.) 泛素/26S蛋白酶体途径 泛素 U-box蛋白 E3泛素连接酶 生物胁迫 盐胁迫
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S512.1
【目录】：

• 中文摘要12-15
• Abstract15-18
• 1 前言18-31
• 1.1 泛素/26S蛋白酶体系统18-24
• 1.1.1 泛素19-20
• 1.1.2 泛素活化酶20
• 1.1.3 泛素结合酶20
• 1.1.4 泛素连接酶20-23
• 1.1.5 26S蛋白酶体23-24
• 1.2 UPS与非生物胁迫耐性24-26
• 1.2.1 泛素（Ub）在非生物胁迫中的作用24
• 1.2.2 U-box与非生物胁迫耐性24-26
• 1.3 UPS与生物胁迫26-28
• 1.3.1 泛素与生物胁迫27
• 1.3.2 U-box与生物胁迫27-28
• 1.4 UPS与植物的生长发育28-30
• 1.4.1 泛素对植物生长发育的影响28
• 1.4.2 U-box蛋白与植物激素对植物生长发育的调控28-30
• 1.5 本研究的目的意义30-31
• 2 材料与方法31-49
• 2.1 实验材料31-33
• 2.1.1 植物材料31
• 2.1.2 材料的培养和处理31
• 2.1.2.1 小麦的培养和处理31
• 2.1.2.2 烟草的培养及处理31
• 2.1.3 菌株和质粒31
• 2.1.4 酶与各种生化试剂31
• 2.1.5 PCR引物31-33
• 2.2 实验方法33-49
• 2.2.1 利用Trizol试剂盒提取RNA33-34
• 2.2.2 反转录cDNA第一条链的合成34
• 2.2.3 CTAB法提取植物基因组DNA34-35
• 2.2.4 3′RACE35-37
• 2.2.5 真核表达载体的构建37
• 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化37-38
• 2.2.7 转化菌落PCR鉴定38
• 2.2.8 质粒的提取38
• 2.2.9 目的片段和质粒DNA的酶切鉴定38-39
• 2.2.10 目的片段与质粒DNA的连接39
• 2.2.11 根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的制备和转化39-40
• 2.2.11.1 根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的制备39
• 2.2.11.2 冻融法转化根癌农杆菌LBA440439-40
• 2.2.12 TaPUB1::GFP融合蛋白亚细胞定位40-41
• 2.2.13 农杆菌介导的植物转化41-42
• 2.2.14 转基因植株的PCR检测42-43
• 2.2.15 荧光定量PCR检测基因的表达43
• 2.2.16 蛋白杂交分析43-46
• 2.2.17 生理指标的测定46-47
• 2.2.18 植物对病原菌抗性分析47-48
• 2.2.19 统计分析48-49
• 3 结果与分析49-79
• 3.1 TaUb2过表达烟草对病原菌的抗性49-54
• 3.1.1 TaUb2过表达烟草对Pst DC3000抗性的表型观察49-50
• 3.1.2 TaUb2过表达改变了烟草叶片气孔对Pst DC3000的响应50-51
• 3.1.3 Pst DC3000感染对转基因烟草抗氧化方面的影响51-52
• 3.1.4 Pst DC3000使转基因烟草发生ROS迸发并诱导HR反应52-53
• 3.1.5 Pst DC3000感染诱发疾病相关基因的表达53-54
• 3.2 小麦U-box基因Ta PUB1的分离及序列特征分析54-57
• 3.2.1 小麦U-box基因TaPUB1的分离54-55
• 3.2.2 TaPUB1全长cDNA及编码蛋白质序列的特征分析55-56
• 3.2.3 TaPUB1序列系统发生分析56-57
• 3.3 TaPUB1的亚细胞定位57-58
• 3.4 TaPUB1基因在小麦中的表达模式分析58-60
• 3.4.1 TaPUB1基因在小麦不同器官中的表达模式58
• 3.4.2 小麦中TaPUB1基因表达水平对不同逆境胁迫处理的响应58-60
• 3.4.3 TaPUB1基因表达对激素的响应模式60
• 3.5 TaPUB1抗体制备60-62
• 3.5.1 原核表达载体pET-TaPUB1的构建60-61
• 3.5.2 TaPUB1蛋白表达及抗体获得61-62
• 3.6 TaPUB1基因在本生烟中的遗传转化62-64
• 3.6.1 35S::TaPUB1真核表达载体的构建62-63
• 3.6.2 转TaPUB1本生烟阳性植株的筛选63-64
• 3.7 过表达TaPUB1本生烟的耐盐性分析64-73
• 3.7.1 过表达TaPUB1对盐胁迫下本生烟种子萌发及幼苗生长的影响64-65
• 3.7.2 过表达TaPUB1对盐胁迫下成苗期本生烟耐盐性的影响65-68
• 3.7.3 盐胁迫对野生型和过表达本生烟渗透调节能力及Na+、K+的影响68-69
• 3.7.4 过量表达TaPUB1增强了转基因本生烟的抗氧化能力69-73
• 3.8 过表达TaPUB1转基因本生烟对其它逆境胁迫的耐性73-75
• 3.8.1 过表达TaPUB1转基因本生烟对水分胁迫的耐性73-74
• 3.8.2 过表达TaPUB1本生烟对重金属胁迫的耐性74-75
• 3.8.3 过表达TaPUB1本生烟对Pst DC3000感染的影响75
• 3.9 过表达TaPUB1对转基因植株生长发育的影响75-79
• 4 讨论79-85
• 4.1 过表达TaUb2提高了转基因烟草对病原菌的抗性79-81
• 4.2 小麦TaPUB1的克隆及其在逆境胁迫耐性中的功能分析81-85
• 5 结论85-86
• 参考文献86-98
• 致谢98-99
• 攻读学位期间发表论文情况99

【共引文献】

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