赖草对盐碱胁迫的生理响应及LsCDPK基因的克隆与功能分析

发布时间：2017-08-10 11:08

  本文关键词：赖草对盐碱胁迫的生理响应及LsCDPK基因的克隆与功能分析

  更多相关文章： 赖草 盐碱胁迫 生理响应 叶绿素荧光诱导动力学 叶肉细胞超微结构 LsCDPK

【摘要】：赖草(Leymus secalinus)是赖草属多年生根茎禾草,无性繁殖能力强,不仅抗逆能力强,且营养价值丰富,是盐碱地生物改良的优质牧草。本研究用NaCl(0、100、200、300、400、500、600、700 mM)、NaHCO3及Na2CO3(0、50、75、100、150、200、300、400 mM)对盆栽赖草幼苗进行胁迫,通过幼苗的生长特性、生理生化、光合荧光、叶肉细胞超微结构等指标分析并探讨了盐碱胁迫对赖草幼苗的伤害和幼苗的抗盐碱能力及机制。同时,克隆了一个Ca2+介导的启动胁迫响应途径的中间基因CDPK(钙依赖蛋白激酶)。为分子水平解释赖草的抗盐碱机制奠定了基础,并为赖草耐盐新品种的驯化选育提供了理论依据。主要研究结果如下：1盐碱胁迫对赖草幼苗生长及生理生化特性的影响(1)赖草叶片相对含水量和生长速度与盐碱浓度呈负相关,Na2CO3胁迫下生长速度降低最为明显(0.59 cm·d-1),其次为NaHCO3 (0.34 cm-d'1),NaCl最小(0.29 cm·d-1)。赖草幼苗的根冠比(R/T)与盐碱浓度呈正相关,随盐碱浓度的增加,R/T增加的速度是Na2CO3大于NaHCO3大于NaCl。(2)赖草幼苗的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性均随盐碱浓度的增加呈现出先增加后降低的趋势,在NaCl 400 mM. NaHCO3 150 mM、Na2CO3浓度100-150mM时,SOD与POD的值达最大。丙二醛(MDA)则是随盐碱浓度的升高在增加。(3)脯氨酸(Pro)、可溶性糖和甜菜碱(BADH)均随盐碱浓度的增加呈现出先增加后降低的趋势。NaCl胁迫下,Pro在600mM达到最大,BADH和可溶性糖在500 mM达最高值。200--300mM NaHCO3 Pro、BADH和可溶性糖达最大。Na2CO3胁迫后Pro、BADH和可溶性糖均在200 mM达最大。3种渗透物质分别在不同浓度下达到最大,这样能有效地进行渗透调节,这可能是赖草耐盐碱的一个原因。(4)叶绿素(Chl)的含量与光合、荧光作用密切相关,不同盐碱浓度胁迫下赖草幼苗Chl a、Chl b和总Chl含量在高浓度NaCl 500 Mm、NaHCO3 400mM和Na2CO 3300mM显著下降；从而导致了净光合速率(Pn)在高浓度时有所下降,在低浓度盐碱胁迫下没有变化；气孔导度(Gs)在所有浓度下均与CK无差异,水分利用效率(WUE)随浓度升高呈现出先增加后降低的趋势。随胁迫时间的延长赖草幼苗的Pn和WUE在降低,蒸腾速率(Tr)和Gs随胁迫时间的延长先增加后降低,Pn的降低主要是由非气孔因素引起。随NaCl、NaHCO3和Na2CO3浓度的增加,Fo先降后升；Fv/Fm、Fv/Fo则降低,Fv/Fm的值明显下降,分别下降了38%、19%和34%。NPQ是光保护的重要指标,随PAR的增加而增大,在现有的光强范围内,NPQ未达到稳定状态,说明荧光猝灭的原因是热耗散增加。低浓度的胁迫下幼苗由于热耗散存在没有受到伤害,随浓度的增加,受损伤的程度增加。(5)NaCl、Na2CO3禾NaHCO3胁迫后,赖草幼苗根系的Na+含量均高于茎叶的含量,Cl-含量是茎叶高于根系,根系的限Na+能力随盐碱浓度的增加在增大。赖草幼苗在300mM NaCl以下不受影响,Na2CO3浓度低于150mM可以通过K+、Ca2+的协调来抵制Na+和Cl-的积累,NaHCO3浓度高于200 mM茎叶Na+和Cl-含量增加,受胁迫严重。随盐碱浓度的增加,Na/K比增加,但茎叶的增加量小于根系,说明赖草是通过根系限制Na+向茎叶运输,从而避免或减轻Na+对茎叶的损伤。从生长、叶片膜脂的伤害程度、保护酶、光合和离子含量等方面分析,400 mMNaCl以下赖草能正常生长；Na2CO3浓度大于150 mM赖草幼苗会受到影响；幼苗可以忍耐200mM的NaHCO3。2盐碱胁迫对赖草叶片叶肉细胞超微结构的影响低浓度盐碱胁迫(NaCl 100 mM、NaHCO3 50mM和Na2CO3 50mM)对叶肉细胞超微结构影响较小。中等浓度盐碱胁迫(NaCl 400 mM、NaHCO3 150mM和Na2CO3150mM)引起叶肉细胞变化,类囊体间隙增大、基粒片层紊乱,淀粉粒较少,线粒体膜开始解体,嗜锇体有所增加。高浓度盐碱胁迫(NaCl 700 mM、NaHCO3 400mM和Na2CO3400mM)细胞变形、叶绿体双层膜解体,基质外渗、嗜锇体明显增大增多、淀粉粒很少或没有。3赖草LsCDPK基因的克隆和表达应用同源序列引物对盐碱胁迫后的赖草进行RACE克隆,从中克隆了CDPK基因,该基因与二穗短柄草SK5-like基因同源性最高,达到94%,命名为LsCDPK。LsCDPK全长2480bp,编码由520个氨基酸组成的蛋白质,属于膜外蛋白,具有亲水性,定位于细胞核中。LsCDPK基因在赖草不同组织和不同逆境胁迫下的表达特异性,表明LsCDPK基因在整个植株中均能表达,且在根中的表达量最大。赖草中的LsCDPK基因能被盐碱、低温和干旱诱导,初步推测LsCDPK基因至少参与了盐碱、低温和干旱逆境胁迫的响应。
【关键词】：赖草 盐碱胁迫 生理响应 叶绿素荧光诱导动力学 叶肉细胞超微结构 LsCDPK
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q945.78;S543.9
【目录】：

• 摘要9-11
• 第一章 文献综述11-22
• 1 盐碱地概述11-12
• 1.1 世界盐碱地概况11
• 1.2 中国盐碱地概况11-12
• 2 盐碱胁迫对植物的影响12-14
• 2.1 渗透胁迫(Osmotic stress)12
• 2.2 离子胁迫(Ion stress)12-13
• 2.3 活性氧胁迫(Reactive oxygen stress)13
• 2.4 细胞膜透性平衡破坏(Cell membrane permeability destroy)13
• 2.5 光合作用减弱(Photosynthesis weaken)13-14
• 2.6 荧光猝灭(Fluorescence quenching)14
• 3 植物耐盐碱胁迫机制14-16
• 3.1 渗透物质的积累15-16
• 3.2 细胞膜保护酶系统的启动16
• 3.3 离子运输和离子区隔化16
• 4 钙依赖蛋白激酶(CDPK)的研究进展16-20
• 4.1 CDPK结构特点17
• 4.2 CDPK在信号转导中的作用17-18
• 4.3 CDPK生物学功能18-20
• 5 赖草及赖草属植物的研究进展20
• 6 本研究的目的和意义20-22
• 第二章 赖草幼苗对盐碱胁迫的生理响应22-47
• 1 研究材料22-23
• 1.1 材料采集地自然概括22
• 1.2 材料的培养22
• 1.3 材料的处理22-23
• 2 指标的测定23-24
• 2.1 生物量指标的测定23
• 2.2 保护酶的测定23
• 2.3 渗透物质的测定23
• 2.4 丙二醛的测定23
• 2.5 相对电导率的测定23-24
• 2.6 离子含量的测定24
• 2.7 数据分析24
• 3 结果与分析24-42
• 3.1 盐碱胁迫对赖草生物量的影响24-27
• 3.2 盐碱胁迫对赖草幼苗保护酶的影响27-29
• 3.3 盐碱胁迫对赖草幼苗渗透物质的影响29-34
• 3.4 盐碱胁迫对赖草幼苗丙二醛的影响34-36
• 3.5 盐碱胁迫对赖草幼苗细胞膜损伤的影响36-37
• 3.6 盐碱胁迫对赖草幼苗离子含量的影响37-42
• 4 讨论42-45
• 5 小结45-47
• 第三章 赖草幼苗对盐碱胁迫的光合生理响应47-67
• 1 材料与方法47-48
• 1.1 材料47
• 1.2 叶绿素含量的测定47
• 1.3 光合特性的测定47-48
• 1.4 数据处理48
• 2 结果与分析48-63
• 2.1 盐碱胁迫对赖草幼苗叶绿素含量的影响48-50
• 2.2 盐碱胁迫对赖草幼苗光合特性的影响50-56
• 2.3 不同胁迫时间对赖草幼苗光合特性的影响56-59
• 2.4 盐碱胁迫对赖草幼苗光合-光响应曲线的影响59-61
• 2.5 盐碱胁迫对赖草幼苗CO_2响应曲线的影响61-63
• 3 讨论63-65
• 4 小结65-67
• 第四章 盐碱胁迫对赖草幼苗叶绿素荧光诱导动力学特性的影响67-78
• 1 材料与方法67-68
• 1.1 材料67
• 1.2 荧光特性的测定67
• 1.3 数据处理67-68
• 2 结果与分析68-75
• 2.1 NaCl胁迫赖草幼苗荧光诱导动力学的影响68-71
• 2.2 NaHCO_3胁迫赖草幼苗荧光诱导动力学的影响71-73
• 2.3 Na_2CO_3胁迫赖草幼苗荧光诱导动力学的影响73-75
• 3 讨论75-77
• 4 小结77-78
• 第五章 盐碱胁迫对赖草幼苗超显微结构的影响78-89
• 1 材料与方法78
• 1.1 材料78
• 1.2 叶片细胞超微结构观察78
• 2 结果分析78-79
• 2.1 NaCl胁迫对赖草叶片叶绿体超微结构的影响78-79
• 2.2 NaHCO_3胁迫对赖草叶片叶绿体超微结构的影响79
• 2.3 Na_2CO_3胁迫对赖草叶片叶绿体超微结构的影响79
• 3 讨论79-81
• 4 小结81-89
• 第六章 赖草LsCDPK基因的克隆及生物信息学分析89-116
• 1 材料与方法89-94
• 1.1 试验材料89-90
• 1.2 方法90-94
• 2 赖草LSCDPK基因cDNA 3'和5'RACE的扩增94-99
• 2.1 赖草LsCDPKK基因3'-RACE的克隆94-96
• 2.2 赖草LsCDPK基因5'-RACE的克隆96-99
• 3 赖草LsCDPK基因的生物信息学分析99-101
• 3.1 核酸序列分析99
• 3.2 蛋白质一级结构分析99
• 3.3 蛋白质二级结构和功能分析99-100
• 3.4 进化分析100-101
• 4 结果与分析101-114
• 4.1 赖草总RNA的提取及鉴定101
• 4.2 赖草LsCDPK基因的克隆及PCR产物的鉴定101-102
• 4.3 LsCDPK基因cDNA全长序列的克隆102-103
• 4.4 LsCDPK基因cDNA的全长序列分析103-105
• 4.5 蛋白质一级结构105
• 4.6 蛋白质二级结构及功能105-111
• 4.7 同源性比较111-113
• 4.8 系统进化树的构建113-114
• 5 讨论与小结114-116
• 第七章 赖草LsCDPK基因的表达分析116-124
• 1 试验材料与试剂116
• 2 试验方法116-118
• 2.1 引物设计116
• 2.2 材料处理116-117
• 2.3 荧光定量PCR117-118
• 2.4 数据处理118
• 3 结果与分析118-122
• 3.1 荧光定量PCR反应条件的确定118-119
• 3.2 赖草LsCDPK基因组织特异性表达119-120
• 3.3 LsCDPK基因在NaCl胁迫下的表达120
• 3.4 LsCDPK基因在Na_2CO_3胁迫下的表达120-121
• 3.5 赖草LsCDPK基因在低温胁迫下的表达121
• 3.6 LsCDPK基因在干旱胁迫下的表达121-122
• 4 讨论与小结122-124
• 第八章 结论与研究展望124-126
• 1 主要结论124
• 2 研究创新点124-125
• 3 研究中存在的问题及后续研究计划125-126
• 参考文献126-137
• Abstract137-141
• 附录一 中英文缩略词表141-142
• 附录二 中英文缩略词表142-143
• 攻读博士期间发表论文143-145
• 致谢145

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本文编号：650353