锦橙晚熟性状机理探讨及候选基因的鉴定

发布时间：2017-08-11 04:28

  本文关键词：锦橙晚熟性状机理探讨及候选基因的鉴定

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【摘要】：果实的成熟是一个集糖酸代谢、细胞壁代谢、色素代谢、能量代谢等多种生物学途径的复杂过程。目前,对于果实成熟的机理研究还不够完善,特别是对于柑橘这种非跃变型水果的成熟机理研究较少。因此研究柑橘的成熟机理,从而有的放矢地选育柑橘早晚熟品种,以及从栽培上调整现有品种的成熟期,对于柑橘产业意义重大。锦橙晚熟芽变的发现,为我们研究柑橘成熟调控提供了有利材料。本文通过比较研究锦橙及其熟期芽变材料的果实在不同发育成熟时期中从生理生化到分子信号层面的差异,对于锦橙发育成熟过程中的变化有了较全面的了解,并且鉴定出多个柑橘发育成熟相关代谢途径及关键基因。主要研究结果如下:1.果实糖酸品质方面:锦橙果实发育成熟过程中,总的可溶性固形物含量、蔗糖含量、果糖含量、葡萄糖含量、维生素C含量、单果重及果皮色泽指数都呈现逐渐上升的趋势至完熟后下降;而总的可滴定酸、柠檬酸和奎宁酸的含量则呈现逐渐下降的趋势,并且在果实成熟中期,晚熟锦橙果实中的柠檬酸含量明显较普通锦橙果实中的高;特殊的是苹果酸含量的变化趋势表现为果实开始转色后逐渐上升至快完熟时逐渐下降。2.内源激素方面:锦橙果实发育过程中,脱落酸在果实中的含量最高,其变化趋势为“M”字型,在果实刚开始转色和快完熟时含量最高;茉莉酸含量较低,总体呈逐渐下降的趋势,不过在发育成熟前期晚熟锦橙果实中的茉莉酸含量明显高于普通锦橙果实;生长素含量最低,并且呈现先逐渐下降待果实完全成熟时稍微上升的趋势。3.基因表达方面:重点分析了蔗糖、脱落酸、茉莉酸代谢及信号转导通路中关键基因在锦橙果实不同发育成熟期的表达量变化趋势。蔗糖合成关键基因为Cs SPS和Cs SUS,二者分别在果实成熟前期和后期发挥作用,前者主要与果实转色后蔗糖含量的上升相关,后者主要与果实中的葡萄糖含量及果糖含量的变化趋势相关;大多数脱落酸信号转导途径相关基因的表达量变化趋势整体表现为随着果实成熟不断上升,揭示了脱落酸在甜橙果实成熟过程中发挥正调控作用;果肉中茉莉酸合成相关基因的表达量变化趋势与内源茉莉酸含量变化趋势不一致,说明在锦橙果实成熟过程中茉莉酸的合成还会受到其它因素的影响,而果实成熟后期茉莉酸信号转导途径中的关键基因的表达量逐渐上升,说明茉莉酸信号转导途径参与了果实的成熟调控过程。此外,这三个通路中有很多基因有着相近的表达模式。4.转录组分析方面:重点分析了普通锦橙及其晚熟芽变果实在转色初始时果肉中的整体转录组差异,共找到13,412个差异Unigene,主要集中于代谢途径、植物-病原菌相互作用、剪接体、植物激素合成和类苯基丙烷合成5个途径。差异表达的转录因子主要集中于Myb、AP2/ERF、MADS-box和WRKY四大家族。此外,随着果实不断成熟,它的整体转录水平反而下降。5.锦橙转录组的SSR分布:在所检测的所有unigene中约11%的序列含有SSR位点,其中主要重复类型依次为单核苷酸、三核苷酸和二核苷酸重复类型;主要重复基序依次为A/T、AG/CT和AAG/CTT。6.SSR分子标记的开发:根据含有SSR位点的正向差异基因序列设计特意引物52对,其中33对能在脐橙、i*柑和宽皮橘中获得清晰的目的条带,说明本次开发的SSR引物在柑橘相近种间具有可转移性;18对在16个熟期差异柑橘品种中获得多态性条带;多态性信息指数最高的unigene为TCP家族成员,其在柑橘果实不同发育成熟期差异表达,并且其启动子区存在多种植物激素调控元件。综上所述,锦橙的晚熟芽变致使果实发育过程中多个代谢途径相关基因以及产物含量都发生了变化,不仅证明果实成熟是个复杂综合的过程,也说明该芽变处于调控网络的上游或者交叉点上,虽然找到这个关键点很难,但是在寻找的过程中发现许多与果实成熟调控相关的途径和基因,为研究果实成熟提供了新的依据和基础。同时新开发的分子标记为柑橘遗传图谱构建、不同品种亲缘关系分析及分子标记辅助育种提供了新的工具。
【关键词】：柑橘 果实成熟 RNA-seq 植物激素 TCP
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S666.4
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 缩略词表12-13
• 第一章 前言13-23
• 1 课题的提出13-14
• 2 前人研究进展14-22
• 2.1 芽变与果实成熟14-15
• 2.2 果实成熟机理研究进展15-20
• 2.2.1 果实成熟相关组学方面研究进展15-16
• 2.2.2 果实成熟相关果实品质研究进展16-17
• 2.2.3 果实成熟相关转录因子及小RNA研究进展17-19
• 2.2.4 果实成熟相关植物激素研究进展19-20
• 2.3 转录组测序与SSR分子标记开发20-22
• 2.3.1 转录组测序的研究进展20-21
• 2.3.2 基于新一代测序技术的SSR分子标记的开发及应用21-22
• 3 本研究的目的和内容22-23
• 第二章 锦橙及其晚熟芽变果实成熟过程中内外品质比较分析23-55
• 1 引言23
• 2 材料与方法23-39
• 2.1 实验材料23-26
• 2.1.1 植物材料23-24
• 2.1.2 主要生化试剂及实验仪器24-26
• 2.2 试验方法26-39
• 2.2.1 砧木遗传背景鉴定26-31
• 2.2.2 果实外观品质测定31
• 2.2.3 果实内在品质测定31-35
• 2.2.4 果实成熟相关基因表达谱测定35-39
• 3 结果与分析39-50
• 3.1 普通锦橙及其晚熟芽变砧木遗传背景分析39-40
• 3.2 锦橙及其晚熟芽变果实外观品质分析40-41
• 3.2.1 果实色泽参数测定40-41
• 3.2.2 单果重及果形指数测定41
• 3.3 锦橙及其晚熟芽变果实内在品质分析41-45
• 3.3.1 果实常规品质分析41-43
• 3.3.2 果实可溶性糖酸含量分析43-45
• 3.3.3 果肉中内源ABA，JA及IAA含量分析45
• 3.4 果实成熟相关基因表达谱分析45-50
• 3.4.1 果实成熟过程中蔗糖合成及信号转导途径关键基因表达谱分析.3345-46
• 3.4.2 果实成熟过程中ABA合成及信号转导途径关键基因的表达谱分析46-47
• 3.4.3 果实成熟过程中JA合成及信号转导途径关键基因表达谱分析47-50
• 4 讨论50-55
• 4.1 锦橙果实发育成熟过程中的果实品质变化50
• 4.2 锦橙果实发育成熟过程中内源激素变化50-52
• 4.3 锦橙果实成熟过程中蔗糖，ABA和JA可能的互作模式52-55
• 第三章 锦橙及其晚熟芽变果实成熟早期转录组分析及SSR分子标记的开发55-98
• 1 引言55-56
• 2 材料与方法56-62
• 2.1 实验材料56
• 2.2 试验方法56-62
• 2.2.1 转录组测序56-58
• 2.2.2 锦橙转录组SSR分布58
• 2.2.3 SSR分子标记的开发58-61
• 2.2.4 qRT-PCR分析基因表达61
• 2.2.5 基因启动子区顺式作用元件分析61-62
• 3 结果与分析62-91
• 3.1 转录组测序62-74
• 3.1.1 转录组测序结果统计62-63
• 3.1.2 Unigene注释63-66
• 3.1.3 差异表达基因分析66-74
• 3.1.4 qRT-PCR验证74
• 3.2 锦橙SSR分布74-77
• 3.2.1 SSR位点搜索74-75
• 3.2.2 SSR重复基序长度及类型分布75-77
• 3.3 SSR分子标记的开发77-82
• 3.3.1 SSR引物的设计77-78
• 3.3.2 SSR引物的筛选78-79
• 3.3.3 SSR引物多态性评价及其应用79-82
• 3.4 熟期候选基因CsTCP2 分析82-91
• 3.4.1 CsTC2P基因在果实发育过程中的表达谱分析82-83
• 3.4.2 CsTCP2 基因及ABA，，JA合成及信号转导途径相关基因启动子区顺式作用元件分析83-91
• 4 讨论91-98
• 4.1 锦橙果实成熟早期转录组水平91-92
• 4.2 基于转录组测序结果的柑橘SSR分子标记的开发及应用92-95
• 4.3 柑橘TCP2 功能探讨95-97
• 4.4 后续研究设想及展望97-98
• 参考文献98-118
• 图版118-121
• 附录Ⅰ 相关数据列表121-136
• 附录II攻读博士期间发表的论文136-137
• 致谢137-138

【参考文献】

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本文编号：654259