基于乳腺上皮FcRn胞吞转运途径的金黄色葡萄球菌多价毒力因子疫苗设计及其诱导免疫应答效果的研究

发布时间：2017-08-12 08:25

  本文关键词：基于乳腺上皮FcRn胞吞转运途径的金黄色葡萄球菌多价毒力因子疫苗设计及其诱导免疫应答效果的研究

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【摘要】：奶牛乳房炎(Bovine Mastitis),是奶牛乳房组织受到外界刺激而引起乳房组织炎性反应的一种疾病。引起奶牛乳房炎的病原菌种类繁多,包括细菌、真菌、病毒和支原体等,其中金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的重要病原菌之一,金黄色葡萄球菌致病的主要毒力因子包括与其表面相关的黏附素、毒素、生物被膜、荚膜多糖和酶等。金黄色葡萄球菌黏附和定植于乳腺上皮细胞,是感染的初始阶段,阻断其对乳腺上皮细胞的黏附和定植,是阻止金黄色葡萄球菌感染的有效策略之一。纤连结合蛋白B(FnBPB)和凝集因子A (ClfA)是奶牛感染金黄色葡萄球菌引起乳房炎的重要黏附因子。FnBPB的D区(FnBPB-D)和ClfA的A区(ClfA-A)是与黏附相关的重要功能区。荚膜多糖也是金黄色葡萄球菌侵入机体,感染初期的重要毒力因子。新生儿Fc受体(Fc receptor, FcRn)作为识别免疫球蛋白IgG的Fc片段的特异性受体,参与跨越黏膜屏障主动转运IgG,同时FcRn还能与结合了抗原的IgGFc段特异性结合,介导黏膜上皮细胞通过胞吞转运IgG与抗原的复合物进入基底层,携带着抗原的IgG释放抗原；而黏膜基底层有大量的抗原递呈细胞,T、B淋巴细胞等,从而诱导特异性的局部免疫,使机体黏膜表面获得抵御病原体的能力。本研究选取Wistar大鼠作为试验动物,在成功克隆大鼠的IgG的Fc片段后,采用SOE-PCR方法,与FnBPB-ClfA进行串联,成功构建了Fc-FnBPB-ClfA串联基因,将其定向克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,经IPTG诱导获得了以可溶性表达的重组蛋白rFc-FnBPB-ClfA。该重组蛋白经SDS-PAGE电泳检测,证明其分子量大小为78 KDa;经Western Blot分析,表明该重组蛋白具有良好的反应原性,且Fc、FnBPB和ClfA均具有蛋白活性。尔后,通过化学偶联方法,以碳二亚胺(EDC)作为偶联剂,将CP8与Fc-FnBPB-ClfA以1.89：1的质量比进行偶联,成功制备偶联物CP8+Fc-FnBPB-ClfA.最后,将上述融合蛋白FnBPB-ClfA、融合蛋白Fc-FnBPB-ClfA、偶联物CP8+FnBPB-ClfA和偶联物CP8+Fc-FnBPB-ClfA分别通过肌肉注射和乳头管注射(乳头管注射部位为右侧腹部第4对乳头,R4)这两种不同的免疫途径,配合铝盐佐剂和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位佐剂(LTB)两种不同的免疫佐剂对处于哺乳期的Wistar大鼠进行免疫。其中,融合蛋白Fc-FnBPB-ClfA免疫组,通过肌肉注射进行首次免疫(muscle, M),经乳头管注射进行加强免疫(teat canal, TC)的免疫方案,配合LTB黏膜佐剂免疫处于哺乳期的Wistar大鼠；同时,用本研究制备的大鼠抗FnBPB-ClfA的血清分别与融合蛋白FnBPB-ClfA和融合蛋白Fc-FnBPB-ClfA等量混合,制成抗原-抗体复合物疫苗,以LTB为佐剂,通过乳头管注射,免疫哺乳期的Wistar大鼠。免疫后通过免疫指标的检测评价各免疫组的免疫效果。通过ELISA方法检测免疫组大鼠血清和乳清中的特异性抗体效价、IgG的亚型测定、Thl/Th2类细胞因子的表达水平；将加强免疫7d后的各免疫组大鼠进行T淋巴细胞增殖试验、大鼠全血的吞噬调理试验及大鼠乳腺组织的免疫组化试验；将加强免疫14d后的大鼠经右侧R4乳头管灌注金黄色葡萄球菌进行攻毒保护试验。结果表明,融合蛋白Fc-FnBPB-ClfA通过肌肉注射进行首次免疫,经乳头管注射进行加强免疫,配合LTB佐剂(M-TC/LTB),加强免疫大鼠7d后,血清和乳清的抗体效价分别可达1：102400和1：1600；血清和乳清中IgG亚型主要以IgG1为主；血清和乳清中IL-4和IFN-γ的含量均有所提高,且高于其他免疫组；T淋巴细胞增殖试验表明,该免疫组淋巴细胞刺激指数,显著高于其他免疫组(p0.05)；全血杀菌能力也显著高于对照组(p0.05)；乳腺组织的免疫组化反应呈棕褐色阳性反应。攻毒保护试验表明,该免疫组金黄色葡萄球菌的检出率显著低于其他各免疫组(p0.05)。综上所述,各免疫组中,融合蛋白Fc-FnBPB-ClfA以LTB为黏膜佐剂,通过肌肉注射进行首次免疫,经乳头管注射进行加强免疫,以这样的免疫方案免疫大鼠后,免疫效果最佳,可诱导机体产生较好的体液免疫反应和细胞免疫反应,并在乳腺部位,诱导产生了良好的局部免疫应答。本研究为今后金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗在生产实践中的运用提供了实验依据。
【关键词】：金黄色葡萄球菌 大鼠IgG Fc片段 乳头管免疫 免疫原性
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.611
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-14
• 1 引言14-22
• 1.1 金黄色葡萄球菌14-16
• 1.1.1 金黄色葡萄球菌的生物学特性14-15
• 1.1.2 金黄色葡萄球菌的毒力因子15-16
• 1.2 奶牛乳腺的免疫防御16-17
• 1.2.1 非特异性免疫应答17
• 1.2.2 适应性免疫应答17
• 1.3 金黄色葡萄球菌疫苗研究进展17-18
• 1.3.1 全菌灭活疫苗17
• 1.3.2 亚单位疫苗17-18
• 1.3.3 核酸疫苗18
• 1.3.4 抗原-抗体复合物疫苗18
• 1.4 FeRn研究进展18-20
• 1.5 免疫佐剂的选择20-21
• 1.6 本研究的目的及意义21-22
• 2 研究一 Fc-FnBPB-ClfA的基因串联22-35
• 2.1 试验材料22-23
• 2.1.1 质粒及菌株22
• 2.1.2 载体与试剂22
• 2.1.3 主要仪器22
• 2.1.4 主要溶液22-23
• 2.2 试验方法23-30
• 2.2.1 试验流程图23-24
• 2.2.2 大鼠的总RNA的提取24
• 2.2.3 反转录24-26
• 2.2.4 大鼠IgG的Fc基因片段的回收及纯化26-27
• 2.2.5 重组质粒pMD19T-Fc的构建27
• 2.2.6 重组质粒pMD19T-Fc的PCR鉴定27-28
• 2.2.7 重组质粒pMD19T-Fc的提取28-29
• 2.2.8 重组质粒pMD19T-Fc的序列测定29
• 2.2.9 Fc基因与FnBPB-ClfA基因的串联29-30
• 2.2.10 重组质粒pMD19T-Fc-FnBPB-ClfA的构建30
• 2.2.11 重组质粒pMD19T-Fc-FnBPB-ClfA的PCR鉴定30
• 2.2.12 重组质粒pMD19T-Fc-FnBPB-ClfA的提取30
• 2.2.13 重组质粒pMD19T-Fc-FnBPB-ClfA序列测定30
• 2.3 结果30-33
• 2.3.1 大鼠总RNA完整性鉴定30-31
• 2.3.2 IgG Fc基因片段的RT-PCR扩增结果31
• 2.3.3 重组质粒pMD19T-Fc序列的测定结果及分析31-32
• 2.3.4 Fc-FnBPB-ClfA串联基因的PCR扩增结果32-33
• 2.4 讨论33-34
• 2.5 小结34-35
• 3 研究二 融合蛋白Fc-FnBPB-ClfA的原核表达及偶联物CP8+Fc-FnBPB-ClfA的制备35-56
• 3.1 试验材料35-37
• 3.1.1 表达载体35
• 3.1.2 试剂35-36
• 3.1.3 主要仪器36
• 3.1.4 主要溶液的配制36-37
• 3.2 试验方法37-45
• 3.2.1 试验流程图37-38
• 3.2.2 重组表达质粒pET32a-Fc-FnBPB-ClfA的构建38-40
• 3.2.3 重组蛋白Fc-FnBPB-ClfA的诱导表达及表达产物分析40-45
• 3.2.4 CP8+Fc-FnBPB-ClfA偶联物的制备45
• 3.3 结果45-54
• 3.3.1 重组表达质粒pET32a-Fc-FnBPB-ClfA的双酶切鉴定45-46
• 3.3.2 重组表达质粒pET32a-Fc-FnBPB-ClfA序列的测定结果及分析46-49
• 3.3.3 IPTG诱导剂最佳浓度的确定49-50
• 3.3.4 重组蛋白的可溶性鉴定50-51
• 3.3.5 重组目的蛋白的纯化51-52
• 3.3.6 Western blot分析结果52-53
• 3.3.7 CP8+Fc-FnBPB-ClfA偶联物定性分析结果53-54
• 3.4 讨论54-55
• 3.4.1 表达系统的选择54
• 3.4.2 重组表达质粒pET32a-Fc-FnBPB-ClfA的构建54-55
• 3.4.3 荚膜多糖与蛋白的偶联55
• 3.5 小结55-56
• 4 研究三 融合蛋白Fc-FnBPB-ClfA、偶联物CP8+Fc-FnBPB-ClfA及抗原-抗体复合物疫苗的免疫效果比较56-95
• 4.1 试验材料56
• 4.1.1 试验动物56
• 4.1.2 重组蛋白与试剂56
• 4.1.3 主要仪器56
• 4.2 试验方法56-67
• 4.2.1 试验流程图56-57
• 4.2.2 融合蛋白Fc-FnBPB-ClfA浓度及偶联物中CP8含量测定57-58
• 4.2.3 免疫动物、免疫程序及分组情况58-60
• 4.2.4 免疫血清和乳清特异性抗体动态检测60-61
• 4.2.5 偶联物免疫组中荚膜多糖和蛋白的特异性抗体检测61
• 4.2.6 免疫血清和乳清中IgG型(IgG1/IgG2a)的测定61
• 4.2.7 T淋巴细胞增殖试验61-62
• 4.2.8 免疫大鼠全血的吞噬调理试验62
• 4.2.9 Th1/Th2类细胞因子水平的检测62
• 4.2.10 大鼠乳腺组织免疫组化试验62-63
• 4.2.11 大鼠乳腺攻毒保护试验63-64
• 4.2.12 大鼠乳腺组织病理组织切片64-67
• 4.3 结果67-89
• 4.3.1 重组蛋白浓度测定结果67
• 4.3.2 偶联物CP8+Fc-FnBPPB-ClfA中CP8含量的测定67-68
• 4.3.3 免疫血清IgG抗体水平动态检测结果68
• 4.3.4 血清和乳清抗体效价检测结果68-72
• 4.3.5 偶联物血清特异性抗体检测结果72-74
• 4.3.6 免疫大鼠血清和乳清中IgG1/IgG2a测定结果74-77
• 4.3.7 T淋巴细胞增殖试验结果77-78
• 4.3.8 吞噬调理试验结果78-79
• 4.3.9 Th1/Th2类细胞因子检测结果79-80
• 4.3.10 大鼠乳腺组织免疫组化试验80-83
• 4.3.11 大鼠的乳头管攻毒保护试验83-87
• 4.3.12 大鼠乳腺组织病理切片结果87-89
• 4.4 讨论89-93
• 4.4.1 金黄色葡萄球菌毒力因子的筛选与Fc的作用89-90
• 4.4.2 乳房炎模型的选择90
• 4.4.3 抗体效价的分析90-91
• 4.4.4 淋巴细胞增殖91
• 4.4.5 吞噬调理试验91-92
• 4.4.6 细胞因子测定和IgG亚型的测定92
• 4.4.7 最佳免疫佐剂的选择92-93
• 4.5 结论93-95
• 5 整体讨论95-96
• 6 整体结论96-97
• 致谢97-98
• 参考文献98-107
• 作者简介107

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：660658