与弓形虫微线体蛋白互作的宿主蛋白的筛选和鉴定

发布时间：2017-08-20 11:27

  本文关键词：与弓形虫微线体蛋白互作的宿主蛋白的筛选和鉴定

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【摘要】：刚地弓形虫是顶复门寄生虫中的一种专性细胞内寄生原虫,是非常重要的人畜共患病原。弓形虫生活史复杂,包括人类在内的几乎所有温血动物均可以作为中间宿主而感染。弓形虫如此广泛的宿主范围与其成功的宿主细胞入侵和调节机制密切相关。在弓形虫入侵和调节宿主细胞的过程中,虫体微线体分泌的微线体蛋白可以黏附宿主细胞并对宿主细胞起到重要的调节作用。尽管多数微线体蛋白均含有不同的黏附结构域,但与微线体蛋白互作的宿主蛋白仍知之甚少,所以鉴定与微线体蛋白特异互作的宿主蛋白可以为进一步阐释弓形虫入侵和调节宿主的机制提供理论依据,同时为宿主蛋白在病原感染时的作用研究奠定基础。为此,本研究从病原与宿主相互作用的角度出发,以弓形虫微线体蛋白AMA1、MIC2和MIC3为诱饵,利用酵母双杂交技术筛选鼠c DNA文库,得到了2个与MIC2整合素A样结构域相互作用的宿主蛋白,8个与MIC3相互作用的宿主蛋白。在此基础上,利用不同的蛋白质互作方法验证了微线体蛋白MIC3与宿主蛋白Spata3和Dkk2在体内、体外的相互作用。之后,对宿主筛选蛋白Dkk2所在的Wnt信号通路进行研究,探索弓形虫对宿主细胞该通路的影响。(1)与弓形虫微线体蛋白相互作用宿主蛋白的筛选利用特异引物从弓形虫RH株速殖子c DNA中扩增微线体蛋白AMA1的胞外域,MIC2的胞外域和MIC3全长编码序列。利用扩增获得的微线体蛋白序列构建酵母双杂交诱饵质粒,并检测诱饵质粒在酵母中的表达,自激活和毒性。由于MIC2胞外域诱饵质粒对酵母双杂交系统存在自激活,因此将其截短成两个结构域——整合素A样结构域(A/I)和血小板反应蛋白重复序列结构域(TSR),并构建诱饵质粒。通过自激活检测发现,TSR结构域是导致MIC2出现自激活的重要结构域,因此用A/I结构域进行宿主蛋白筛选。通过酵母接合的方式对鼠c DNA文库进行筛选,得到2个可以与MIC2-A/I相互作用的宿主蛋白,分别为鼠LAMTOR1和RNase H2b;得到8个可以与MIC3相互作用的宿主蛋白,分别为鼠的Svil,Phf7,Dkk2,Tmem100,Spata3 iso2,Spata3 iso3和两个非典型蛋白LOC72128,LOC210940;未筛选到与AMA1相互作用的宿主蛋白。(2)MIC3阳性互作的验证利用MIC3筛选的宿主蛋白编码序列设计引物,从鼠c DNA中成功扩增得到Phf7,Dkk2,Tmem100和Spata3 iso3全长编码序列,从文库质粒中扩增得到Svil和两个非典型蛋白的文库插入片段序列。分别构建酵母双杂交诱饵质粒,并与构建在p GADT7的MIC3进行点对点验证,发现MIC3与Dkk2,Spata3全长以及两个非典型蛋白文库插入片段存在相互作用。此外,将MIC3连入原核表达载体融合表达GST-MIC3蛋白,将宿主蛋白Spata3、Dkk2连入另一种原核表达载体融合表达His-Spata3和His-Dkk2蛋白。分别纯化蛋白并用GST-Pull down验证了MIC3与宿主蛋白Spata3,Dkk2在体外存在相互作用。将MIC3和宿主蛋白Spata3,Dkk2分别连接入不同的真核表达载体构建重组质粒,利用免疫共沉淀和双分子荧光互补验证了MIC3与宿主蛋白Spata3,Dkk2在哺乳动物细胞内存在相互作用。(3)MIC3与宿主蛋白互作结构域的确定根据文献报道和生物信息学分析将全长MIC3分为两个结构域——几丁质结合样结构域(CBL)和表皮生长因子样结构域(EGF)。分别将这两个结构域构建至p GADT7载体,利用酵母双杂交点对点与MIC3筛选的宿主蛋白诱饵质粒进行相互作用鉴定。结果显示,CBL结构域不能与任何筛选宿主蛋白相互作用;与全长MIC3相同,EGF结构域可以同宿主蛋白Spata3,Dkk2和两个非典型蛋白进行相互作用,说明EGF结构域是MIC3与宿主蛋白相互作用的关键结构域。(4)弓形虫对宿主Wnt/β-catenin信号通路的影响由于MIC3筛选的宿主蛋白Dkk2具有调节宿主Wnt/β-catenin信号通路的功能,因此我们研究弓形虫对宿主该信号通路的影响。利用TOP-Flash萤火虫荧光素酶报告基因系统进行检测,发现弓形虫不同感染丰度都不能对宿主Wnt信号转导产生明显的影响;同时构建MIC3真核表达质粒,利用MIC3真核表达蛋白刺激宿主细胞进行检测,发现MIC3蛋白对宿主该信号转导也无明显影响;通过Western blot对弓形虫速殖子感染或MIC3蛋白表达的宿主细胞进行分析,发现弓形虫速殖子和MIC3蛋白不能使Wnt信号通路关键元件β-catenin的表达量出现明显变化。以上结果表明,弓形虫速殖子和MIC3蛋白不能对宿主Wnt/β-catenin信号通路产生影响。本研究利用多种蛋白质互作技术对与弓形虫微线体蛋白互作的宿主蛋白进行筛选和鉴定,并探索弓形虫对宿主生长发育重要信号通路的影响。该研究不仅加深了我们对弓形虫入侵和感染宿主机制的理解,更为弓形虫新型药物和疫苗的开发提供了理论基础。
【关键词】：弓形虫 微线体蛋白 蛋白互作 宿主蛋白 Spata3 Dkk2
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.7
【目录】：

• 中文摘要8-10
• Abstract10-13
• 缩略表13-15
• 1 文献综述15-34
• 1.1 弓形虫概述15-18
• 1.1.1 弓形虫及弓形虫病15-16
• 1.1.2 弓形虫的生活史16-17
• 1.1.3 弓形虫的宿主17-18
• 1.2 弓形虫感染宿主机制的研究进展18-21
• 1.2.1 弓形虫入侵宿主细胞的过程18-20
• 1.2.2 弓形虫对宿主细胞的调节20-21
• 1.3 弓形虫微线体蛋白的研究进展21-28
• 1.3.1 MIC1/MIC4/MIC6 复合物25
• 1.3.2 MIC2/M2AP复合物25-26
• 1.3.3 MIC3/MIC8 复合物26
• 1.3.4 AMA1 以及移动接点复合物26-27
• 1.3.5 其他微线体蛋白27-28
• 1.4 弓形虫蛋白与宿主蛋白相互作用的研究进展28-29
• 1.5 蛋白质互作技术的研究进展29-34
• 1.5.1 酵母双杂交29-31
• 1.5.2 免疫共沉淀31
• 1.5.3 Pull-down31-32
• 1.5.4 双分子荧光互补32-34
• 2 研究目的与意义34-35
• 3 材料与方法35-62
• 3.1 实验材料35-38
• 3.1.1 实验动物35
• 3.1.2 虫株、菌株和细胞35
• 3.1.3 载体与质粒35-37
• 3.1.4 引物37-38
• 3.2 主要仪器与试剂38-42
• 3.2.1 主要仪器38-39
• 3.2.2 主要试剂盒39
• 3.2.3 主要试剂39-40
• 3.2.4 主要溶液的配制40-42
• 3.3 实验方法42-62
• 3.3.1 弓形虫RH株速殖子的培养、收集与纯化42-43
• 3.3.2 弓形虫RH株基因组DNA的提取43
• 3.3.3 弓形虫RH株速殖子总RNA的提取43-44
• 3.3.4 弓形虫RH株速殖子cDNA的制备44
• 3.3.5 弓形虫微线体蛋白AMA1、MIC2 和MIC3 编码序列的获得44-45
• 3.3.6 重组载体的构建45-48
• 3.3.7 酵母双杂交48-53
• 3.3.8 与微线体蛋白MIC3 互作的宿主蛋白编码序列的获得53
• 3.3.9 原核表达与表达产物的纯化53-56
• 3.3.10 GST Pull-down56-57
• 3.3.11 哺乳动物细胞的培养和转染57-58
• 3.3.12 免疫共沉淀58-59
• 3.3.13 Western blot59
• 3.3.14 双分子荧光互补59-60
• 3.3.15 弓形虫速殖子对宿主Wnt/β-catenin信号通路的影响60
• 3.3.16 微线体蛋白MIC3 对宿主Wnt/β-catenin信号通路的影响60-62
• 4 结果与分析62-97
• 4.1 弓形虫微线体蛋白AMA1，MIC2 和MIC3 编码基因的分析和获得62-64
• 4.1.1 弓形虫微线体蛋白AMA1，MIC2 和MIC3 蛋白初级结构的分析62-63
• 4.1.2 弓形虫微线体蛋白AMA1，，MIC2 和MIC3 编码基因的获得63-64
• 4.2 酵母双杂交诱饵质粒的构建，表达，自激活和毒性检测64-70
• 4.2.1 酵母双杂交诱饵质粒的构建64
• 4.2.2 酵母质粒在酵母中的表达检测64-65
• 4.2.3 诱饵质粒的自激活和毒性检测65-66
• 4.2.4 MIC2 不同结构域酵母双杂交诱饵质粒的构建66-68
• 4.2.5 MIC2 不同结构域诱饵质粒在酵母中的表达检测68-69
• 4.2.6 MIC2 不同结构域诱饵质粒的自激活和毒力检测69-70
• 4.3 酵母双杂交筛选与弓形虫微线体蛋白AMA1、MIC2 和MIC3 相互作用的宿主蛋白70-76
• 4.3.1 宿主互作蛋白的初步筛选70-71
• 4.3.2 候选阳性克隆插入片段大小的鉴定及质粒拯救71-73
• 4.3.3 候选阳性互作的回返验证73
• 4.3.4 阳性插入片段的测序鉴定73-75
• 4.3.5 阳性互作宿主蛋白的GO分类分析75-76
• 4.4 MIC3 与筛选宿主蛋白互作的验证76-90
• 4.4.1 MIC3 筛选宿主蛋白编码基因的获得76-78
• 4.4.2 MIC3 与筛选宿主蛋白的酵母点对点验证78-79
• 4.4.3 MIC3 与宿主蛋白Spata3，Dkk2 相互作用的体外Pull-down验证79-85
• 4.4.4 免疫共沉淀验证MIC3 与宿主蛋白Spata3 和Dkk2 的相互作用85-88
• 4.4.5 双分子荧光互补验证MIC3 与宿主蛋白Spata3 和Dkk2 的相互作用88-90
• 4.5 MIC3 与宿主蛋白互作结构域的鉴定90-92
• 4.6 弓形虫对宿主Wnt/β-catenin信号通路的影响92-97
• 4.6.1 弓形虫速殖子对宿主Wnt信号转导的影响92-93
• 4.6.2 微线体蛋白MIC3 对宿主Wnt信号转导的影响93-95
• 4.6.3 弓形虫速殖子和MIC3 蛋白对宿主Wnt信号调控因子 β-catenin表达量的影响95-97
• 5 讨论97-106
• 5.1 与弓形虫微线体蛋白互作宿主蛋白的筛选97-101
• 5.1.1 鉴定与弓形虫微线体蛋白AMA1、MIC2 和MIC3 互作的宿主蛋白的重要性97-98
• 5.1.2 酵母双杂交系统的选择、应用98-99
• 5.1.3 诱饵质粒的自激活和毒性检测99-100
• 5.1.4 宿主蛋白的初步筛选100-101
• 5.2 MIC3 阳性互作的验证以及功能分析101-102
• 5.3 MIC3 互作结构域的鉴定102-103
• 5.4 弓形虫对宿主Wnt信号通路的影响103-106
• 6 总结106-107
• 参考文献107-122
• 致谢122-124
• 附录 1124-131
• 附录 2131-132

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 孙丽华;范峰;王家俊;龚健;;急性弓形虫感染对雄性小鼠睾丸生精功能影响的初步研究[J];中华男科学杂志;2008年01期

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3 GAO Xue Juan;FENG Jun Xia;ZHU Sen;LIU Xiao Hui;TARDIEUX Isabelle;LIU Lang Xia;;Protein Phosphatase 2C of Toxoplasma Gondii Interacts with Human SSRP1 and Negatively Regulates Cell Apoptosis[J];Biomedical and Environmental Sciences;2014年11期

4 傅俊江,卢光t,李麓芸,刘刚,邢晓为,刘上峰;睾丸生精细胞凋亡相关基因TSARG1与Mtsarg1的分子克隆及Mtsarg1基因的表达谱分析[J];遗传学报;2003年01期

本文编号：706372