烟草腋芽发育相关基因的克隆与功能分析

发布时间：2017-08-21 03:11

  本文关键词：烟草腋芽发育相关基因的克隆与功能分析

  更多相关文章： 烟草 腋芽 NtLS基因 NtBRC1-Like基因 NtRAX2基因

【摘要】：植物分枝发育在植物形态建成中具有十分重要的地位。研究表明,植物的分枝发育过程受遗传因素和环境条件等的共同影响。对植物侧枝发育有显著调控作用的基因大部分属于GRAS、TCP或R2R3-MYB基因家族,这三个基因家族均编码植物转录因子。其中,GRAS基因家族成员在植物生长发育的许多方面发挥重要的作用;TCP家族是一类与植物器官三维形态发育以及细胞周期调控相关的转录因子;R2R3-MYB转录因子广泛参与植物的初生和次生代谢、响应生物和非生物胁迫等过程。本研究对烟草全基因组内GRAS和TCP基因家族进行了鉴定和生物信息学分析,在此基础上,分别克隆了属于GRAS基因家族的烟草Nt LS基因、属于TCP基因家族的Nt BRC1-Like基因和属于R2R3-MYB基因家族的Nt RAX2基因,它们的直系同源基因都与植物侧枝发育相关。对Nt LS和Nt RAX2基因进行过表达分析、基因沉默研究以及拟南芥互补实验验证,探索其对烟草腋芽发生和发育的影响,为利用遗传操作培育无腋芽或少腋芽的烟草新种质奠定基础。本文获得的主要结果如下:(1)在烟草基因组中鉴定了95个GRAS家族成员,根据系统进化的分析结果将它们分为十个亚家族。所有的Nt GRAS成员都含有5个高度保守的motif,分别是LHR I、VHIID、LHR II、PFYRE和SAW。该基因家族中约88.42%的基因没有内含子,有定位信息的84个成员分布在烟草的22条染色体上。烟草GRAS基因参与很多生物学过程的调控,约74%的Nt GRAS蛋白是细胞核定位。被选取进行荧光定量分析的22个Nt GRAS基因中大多数在根和叶片的表达量最高。(2)在烟草基因组中鉴定了61个TCP家族成员,根据系统进化的分析结果将它们分为Class I和Class II两个亚家族,其中Class II又可以分为CIN和CYC/TB1亚簇。所有的Nt TCP蛋白都含有高度保守的TCP-domian,有12个成员还另外包含一个R-domian,这12个Nt TCP蛋白中有10个属于CYC/TB1亚簇。该基因家族中约67.2%的基因没有内含子,有定位信息的54个成员分布在烟草的20条染色体上。被选取进行荧光定量分析的22个Nt TCP基因中绝大多数在叶片的表达量最高。(3)从普通烟草中克隆了Nt LS基因的2条拷贝,Nt LS-S和Nt LS-T,前者来自于林烟草,后者来自于绒毛状烟草。二者序列极为相似,且都没有内含子,分别与GRAS基因家族中的Nt LS和Nt LSa基因相对应。Nt LS-S和Nt LS-T基因的表达模式与番茄Le LS、拟南芥At LAS和菊花Dg LSL的表达模式相似。对Nt LS基因构建过表达载体和CRES-T载体并进行遗传转化,获得的T0代过表达转基因烟草比非转基因烟草更早出现腋芽,而且Nt LS-S基因能恢复拟南芥las突变体的表型。(4)从普通烟草中克隆了4个Nt BRC1-Like基因,命名为Nt BRC1-Like1、2、3和4,分别与TCP基因家族中的Nt TCP18a、b、c和d相对应。这4个基因属于与植物侧枝发育相关的CYC/TB1亚家族,且Nt BRC1-Like1/4、Nt BRC1-Like2/3两两的遗传距离较近。4个Nt BRC1-Like基因编码的蛋白除具有核心的TCP-domain外,还具有CYC/TB1簇蛋白特有的R-domain。4个Nt BRC1-Like基因在不同的组织中呈现特异性表达,且其表达模式可分为两种:1和4的表达模式相似,在腋芽中高度表达;2和3的表达模式十分相像,在叶和腋芽中的表达量都显著高于其它组织。Nt BRC1-Like2和3被证实是Nt BRC1b基因分别来自于林烟草和绒毛状烟草的2条拷贝,Nt BRC1b-S和Nt BRC1b-T。为了探索Nt BRC1b基因的功能,对其构建了过表达载体,正在研究其功能。(5)从普通烟草中克隆了Nt RAX2基因的2条拷贝,来自于林烟草的Nt RAX2-S和来自于绒毛状烟草的Nt RAX2-T,二者序列高度相似。Nt RAX2-S和Nt RAX2-T在腋芽和花中高度表达,在花芽和茎尖中的表达也维持较高的水平。对Nt RAX2基因构建过表达载体和CRES-T载体并进行遗传转化,获得的T0代过表达转基因烟草比非转基因烟草更早出现腋芽,并且Nt RAX2-T能使拟南芥rax2突变体的表型得到恢复。
【关键词】：烟草 腋芽 NtLS基因 NtBRC1-Like基因 NtRAX2基因
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S572
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-15
• 英文缩略表15-16
• 第一章 绪论16-29
• 1.1 高等植物茎的分枝发育16-17
• 1.1.1 茎分枝的形成16
• 1.1.2 植物分枝类型16-17
• 1.1.3 植物分枝发育的理化模式17
• 1.2 控制植物分枝发育的相关基因及调控机制17-24
• 1.2.1 腋芽起始阶段的相关基因17-18
• 1.2.2 分枝发育的激素调控机制18-23
• 1.2.3 环境条件对植物分枝的影响23-24
• 1.3 与植物分枝发育相关的几个重要基因家族的研究进展24-26
• 1.3.1 GRAS转录因子家族研究进展24-25
• 1.3.2 TCP转录因子家族研究进展25
• 1.3.3 R2R3-MYB转录因子家族研究进展25-26
• 1.4 嵌合抑制基因沉默技术26-27
• 1.5 本研究的目的意义和技术路线27-29
• 1.5.1 目的意义27
• 1.5.2 技术路线27-29
• 第二章 烟草GRAS基因家族分析与比较分析29-50
• 2.1 材料与方法29-31
• 2.1.1 基因组数据库和蛋白质序列来源29
• 2.1.2 烟草全基因组GRAS基因家族成员鉴定29-30
• 2.1.3 烟草GRAS蛋白的系统进化和保守结构域分析30
• 2.1.4 NtGRAS基因的染色体定位30
• 2.1.5 NtGRAS蛋白亚细胞定位预测30
• 2.1.6 烟草GRAS基因家族的表达模式分析和GO分析30
• 2.1.7 荧光定量PCR（qRT-PCR）分析30-31
• 2.2 结果与分析31-48
• 2.2.1 烟草GRAS蛋白的鉴定与分类31-32
• 2.2.2 烟草GRAS家族系统进化及基因结构分析32-35
• 2.2.3 GRAS基因家族的比较基因组分析35
• 2.2.4 烟草GRAS蛋白的序列特征及保守域分析35-41
• 2.2.5 烟草GRAS基因的染色体分布41-43
• 2.2.6 烟草GRAS蛋白的亚细胞定位43
• 2.2.7 烟草GRAS基因的表达模式分析与GO分析43-46
• 2.2.8 荧光定量PCR（qRT-PCR）分析46-48
• 2.3 讨论48-50
• 第三章 烟草TCP基因家族分析与比较分析50-66
• 3.1 材料与方法50-51
• 3.1.1 基因组数据库和蛋白质序列来源50
• 3.1.2 烟草全基因组TCP基因家族成员鉴定50
• 3.1.3 烟草TCP蛋白的系统进化和保守结构域分析50
• 3.1.4 NtTCP基因的染色体定位50
• 3.1.5 NtTCP蛋白亚细胞定位预测50-51
• 3.1.6 烟草TCP基因家族的表达模式分析51
• 3.1.7 荧光定量PCR（qRT-PCR）分析51
• 3.2 结果与分析51-64
• 3.2.1 烟草TCP蛋白的鉴定与分类51-52
• 3.2.2 烟草TCP家族系统进化分析及基因结构分析52-54
• 3.2.3 烟草TCP基因家族的比较基因组分析54-55
• 3.2.4 烟草TCP蛋白的序列特征及保守域分析55-59
• 3.2.5 烟草TCP基因的染色体分布59-60
• 3.2.6 烟草TCP蛋白的亚细胞定位60-61
• 3.2.7 烟草TCP基因的表达模式分析61-63
• 3.2.8 荧光定量PCR（qRT-PCR）分析63-64
• 3.3 讨论64-66
• 第四章 烟草LS基因的克隆与功能分析66-91
• 4.1 材料和试剂66-69
• 4.1.1 材料66-68
• 4.1.2 主要试剂和药品68-69
• 4.2 试验方法69-78
• 4.2.1 NtLS基因的克隆69-72
• 4.2.2 NtLS基因的序列分析72
• 4.2.3 NtLS基因的表达模式分析72-73
• 4.2.4 NtLS基因表达载体的构建73-74
• 4.2.5 过表达载体的遗传转化74-78
• 4.2.6 CRES-T表达载体的烟草遗传转化78
• 4.3 结果与分析78-89
• 4.3.1 烟草总RNA的纯度和完整性检测78-79
• 4.3.2 NtLS基因的克隆79
• 4.3.3 NtLS基因双拷贝的序列分析79-81
• 4.3.4 NtLS基因的荧光定量表达分析81-82
• 4.3.5 普通烟草过表达NtLS基因的研究82-85
• 4.3.6 NtLS-S基因对拟南芥las突变体的互补作用85-88
• 4.3.7 NtLS及其所在家族其它成员的基因沉默研究88-89
• 4.4 讨论89-91
• 第五章 烟草BRANCHED1-Like基因的克隆与表达载体构建91-104
• 5.1 材料91-93
• 5.1.1 数据与软件91-92
• 5.1.2 植物材料92
• 5.1.3 主要试剂92-93
• 5.2 试验方法93-94
• 5.2.1 NtBRC1-Like基因的电子克隆路线93
• 5.2.2 NtBRC1-Like基因cDNA的获得93
• 5.2.3 NtBRC1-Like蛋白序列分析93
• 5.2.4 NtBRC1-Like蛋白的保守结构域与系统进化分析93-94
• 5.2.5 烟草BRC1-Like基因的表达模式分析94
• 5.2.6 过表达载体的构建与农杆菌的转化94
• 5.3 结果与分析94-102
• 5.3.1 NtBRC1-Like基因全长cDNA的获得94-95
• 5.3.2 NtBRC1-Like基因编码蛋白的理化性质分析95
• 5.3.3 NtBRC1-Like蛋白的结构特征分析95-96
• 5.3.4 NtBRC1-Like蛋白的二级结构预测及磷酸化位点分析96-97
• 5.3.5 NtBRC1-Like蛋白的保守结构域与系统进化分析97-99
• 5.3.6 NtBRC1-Like基因的表达模式分析99-100
• 5.3.7 NtBRC1-Like2和NtBRC1-Like3基因的序列分析100-101
• 5.3.8 过表达载体的构建与农杆菌转化101-102
• 5.4 讨论102-104
• 第六章 烟草RAX2基因的克隆与功能分析104-117
• 6.1 材料和试剂104
• 6.1.1 材料104
• 6.1.2 主要试剂和药品104
• 6.2 试验方法104-106
• 6.2.1 NtRAX2基因的克隆104-105
• 6.2.2 NtRAX2基因的序列分析105
• 6.2.3 NtRAX2基因的表达模式分析105
• 6.2.4 NtRAX2基因表达载体的构建105-106
• 6.2.5 过表达载体的遗传转化106
• 6.2.6 CRES-T表达载体的烟草遗传转化106
• 6.3 结果与分析106-115
• 6.3.1 NtRAX2基因的克隆106-107
• 6.3.2 NtRAX2基因双拷贝的序列分析107-109
• 6.3.3 NtRAX2基因的荧光定量表达分析109
• 6.3.4 普通烟草过表达NtRAX2基因的研究109-112
• 6.3.5 NtRAX2-T基因对拟南芥rax2突变体的互补作用112-114
• 6.3.6 NtRAX2及其所在家族其它成员的基因沉默研究114-115
• 6.4 讨论115-117
• 第七章 全文结论与展望117-119
• 参考文献119-128
• 附录128-136
• 致谢136-137
• 作者简历137-138

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本文编号：710482